促腎上腺皮質激素對母豬肝中葡萄糖代謝相關酶轉錄表達及活性的影響

孫 曄，曾梓菡，賈璨燦，寧彩波，吳望軍，趙 芳*，劉紅林*

(1. 南京農業大學動物醫學院，南京 210095； 2.南京農業大學動物科技學院 動物遺傳育種研究室，南京 210095)

現代集約化動物生產過程中難以避免應激的發生[1-2]。應激是指動物機體對威脅自身穩態事件所產生的一系列生物反應。應激發生后，機體下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)系統被激活，下丘腦釋放促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)，CRH促使垂體釋放促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)，ACTH作用于腎上腺皮質，上調皮質醇等腎上腺皮質類激素的分泌，從而調動機體各個組織器官應對外界刺激[3-4]。在豬生產中，應激被認為是損害豬生產性能的主要因素[5-6]。斷奶或環境因素產生的應激會影響豬的采食量，降低豬日增重和飼料轉化率，造成豬生長緩慢[7-8]。熱應激會破壞豬的腸道屏障功能，降低部分消化酶活性，影響腸道微生物菌群平衡[9]。運輸應激引起豬緊張不安，導致體溫升高，降低豬肉品質[10]。除了對生長性能的影響，應激還會損害動物的免疫系統。研究發現，熱應激后豬血清中細胞炎癥因子IL-2、IFN-γ及TNF-α水平改變，機體的細胞免疫功能被抑制[11]。運輸后豬的血清總蛋白下降，抗體生成減少，極易發生腹瀉或呼吸道疾病甚至猝死[12-13]。對于生產母豬，溫度升高會降低母豬的采食量及泌乳量，進而降低母豬體重，影響仔豬生長速率[14]。此外，應激會嚴重影響母豬的繁殖性能。應激導致母豬體內激素分泌紊亂，使母豬卵巢卵泡發育受阻、排卵減少，延遲母豬斷奶后發情，嚴重時會誘發卵巢囊腫，增加母豬繁殖障礙的幾率，給養殖場造成巨大的經濟損失[15-17]。因此，研究應激反應的作用機制對了解豬的應激損傷意義重大。

血液中皮質醇濃度升高是衡量應激發生的重要指標。皮質醇刺激脂解和糖質新生，增加血糖供應，為機體應激應答提供更多的能量[18]。外源ACTH注射顯著增加血液皮質醇水平，上調血糖水平，模擬應激的發生[19]。作為血糖來源的主要器官，肝中存在與糖原合成、糖原分解、糖酵解、糖異生、磷酸戊糖途徑等糖代謝相關的酶類，它們的表達及活性是決定葡萄糖代謝正常進行的關鍵因素[20-22]。盡管近年來國內外對豬應激的研究取得了一定的進展，但應激對血糖指標變化的作用機理還有待進一步探討。

為了明確應激引起的高皮質醇水平對母豬肝血糖調控機制的影響，本試驗對母豬注射促腎上腺皮質激素(ACTH)，通過檢測母豬肝中糖代謝相關酶類的轉錄表達及酶活性，解析應激對肝血糖調控的影響機制，為進一步了解應激對母豬生產性能的影響提供一定的理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設計

試驗母豬由江蘇淮陰種豬場提供。選取9頭，體重為(185±25) kg的健康經產斷奶蘇淮母豬，產后40天斷奶，隨機分成處理組(5頭)和對照組(4頭)。 斷奶當天對母豬進行頸靜脈插管手術，斷奶后第2天開始試驗(試驗的第1天)。處理組于每天的8:00、16:00、24:00時(間隔8 h)分別注射1 IU·kg-1ACTH，同時給對照組受試母豬注射等量生理鹽水，連續注射7 d。試驗母豬自由采食、飲水，于試驗第8天進行屠宰取樣。

1.2 試劑

ACTH(A6303)購自Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；M-MLV Reverse Transcriptase、SYBR Premix Ex Taq TM購自TaKaRa公司；皮質醇放射免疫分析試劑盒購自北京北方生物公司。葡萄糖代謝相關酶活性檢測試劑盒購自索萊寶科技有限公司，具體貨號： 6-磷酸葡萄糖脫氫酶(BC0260)、丙酮酸激酶(BC0540)、己糖激酶(BC0740)、糖原磷酸化酶(BC3340)、糖原合成酶(BC3330)、丙酮酸羧化酶(BC0730)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(BC3310)、果糖-1,6-二磷酸酶(BC0920)、葡萄糖-6-磷酸酶(BC3320)、果糖-6-磷酸激酶(BC0530)。

1.3 樣品采集

每天采用一次性負壓采血管(含肝素鈉)由頸靜脈插管采血10 mL。所有血液樣品經3 000 r·min-1離心 10 min，分離血漿，于-20 ℃中保存，用于血糖和皮質醇水平的測定。試驗母豬屠宰后，迅速采集肝組織，置于液氮中凍存。

1.4 血糖及皮質醇測定

將分離的待測血漿送至南京市軍區總醫院，利用全自動生化分析儀對血糖(GLU)進行檢測分析；采用放射免疫法測定血漿皮質醇濃度。

1.5 實時熒光定量PCR

根據NCBI核酸數據庫中相應基因mRNA的全序列，利用Primer premier5.0軟件設計引物，引物由金唯智生物公司合成(引物序列見表1)。Trizol 法提取肝樣品中的總RNA,紫外分光光度計檢測RNA質量和濃度，進行反轉錄及熒光定量PCR擴增。反應體系：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL， 上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL，總體積20 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min； 95 ℃變性10 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40個循環。被檢樣品均重復3次，取平均值；以GAPDH作為內參基因，利用2- △△Ct法計算各基因的相對表達量[23]，△Ct = Ct目的基因-Ct內參基因；△△Ct=(Ct處理組目的基因-Ct處理組內參基因)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內參基因)，2-△△Ct表示處理組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數。

1.6 葡萄糖代謝相關酶類活性測定

根據試劑盒說明書，取適量肝組織，按照組織質量(g)∶提取液體積(mL)為1∶(5～10)的比例，冰浴勻漿；于8 000 g 4 ℃離心10 min，取上清，置冰上；分光光度計波長設置為340 nm，用蒸餾水調零，加樣檢測葡萄糖代謝相關酶活性。

1.7 數據統計分析

所有數據均用“平均數±標準差”表示，利用SPSS 20.0軟件進行統計，采用獨立樣本t檢驗分析試驗組與對照組之間的差異；*表示處理組與對照組比較差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結 果

2.1 ACTH處理對母豬血液皮質醇濃度及血糖水平的影響

母豬血液皮質醇濃度變化如圖1所示。試驗第1天，ACTH處理組母豬血液皮質醇濃度急劇升高，組間差異極顯著(P<0.01)；試驗第1到第4天，ACTH處理組皮質醇濃度下降，但仍顯著高于對照組(P<0.05)；試驗第4到第7天，處理組皮質醇濃度穩定，處理組與對照組差異顯著(P<0.05)。試驗期間，對照組母豬血液中皮質醇濃度穩定，沒有顯著變化。

母豬血糖水平變化如圖2所示，試驗期間處理組血糖水平均高于對照組，且同一時間段組間差異均達顯著水平(P<0.05)。

表1實時熒光定量PCR引物列

Table1Primersforthereal-timequantitativePCRassay

基因Gene引物對序列(5′→3′)Sequence of primerNCBI登錄號NCBI accession No.PYGLF: CATCGTGAAGACCCAAGTATR:GCCCAGGAAGTGGTGTAGNM_001123172.1GYS1F:CTATGTGCTGGTGCTGTGGAR:CTCCATGCAGTAGCGGTGATNM_001195508.1GYS2F:ATGTCACCGTGGTGGTGTTTR:GCTGAGGATGGGATCAGTGGNM_001195511.1HK1F:GTGAAGCTGCTTGAGAAAGCCR:TTGATGCACATCCTGCCCTCNM_001243184.1HK2F: AGATGATCGCCTCGCATCTGR: GCTCCAAGCCCTTTCTCCATNC_010445.3HK3F: CCAGTTGCTACGAGATGCCAR:GGTGTCTACAACCAGCCCAANC_010444.3PFKLF:GGCCCAGACTTACTCACACCR:TCGATGACCTCCATGATGCGXM_013990207PKLRF:CTTCCCTGTGCTCTACCGTGR:CCACGGAGTTTTCCGCTTTCXM_005663320.1G6PCF:TCGGTGCCACTGATAAAGCR:GGGAAATGAGCAGCAAGGTNM_001113445.1FBPF:ATCCTCCAACATCGACTGCCR:ACTAGGGTCGCACTTCCGTANM_001167632.2PCF:CTGGCTACGGGTTCCTGTCCR:CCACCTTGTCTCCCATCTTGCNM_214349.1PCK1F:ATCCGACCTTCCTTGACCATR:TCAGCCTCTTGATGACACCCNM_001123158.1PCK2F:ATGGCGACTTCGTCAAGTGTR:CCGAAAGAGACGATCTCCCGXM_005666229.1GRF:CTCAGCAGCAACGGGACCACR:TGAAGACACTTTCTGTAGCGGCATNM_001008481.1β-actinF: CCTGGACTTCGAGCAGGAGATGGR: TGTCGGCGATGCCTGGGTAXM_003124280.4

F.上游引物；R.下游引物

F.Forward primer; R. Reverse primer

*表示處理組與對照組比較差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同
* indicate significant difference (P<0.05), ** indicate extremely significant difference (P<0.01) between treatment and control groups. The same as the following figures
圖1 ACTH處理對母豬血液中皮質醇濃度的影響
Fig.1 Effects of ACTH-treatment on concentrations of cortisol in the blood of sows

2.2 ACTH處理對母豬肝中糖代謝相關酶類轉錄活性的影響

母豬肝糖異生相關酶類mRNA表達水平如圖3所示。對照組與處理組母豬肝中丙酮酸羧化酶(PC)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2(PCK2)的mRNA表達水平差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，ACTH處理組母豬肝中葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)的mRNA表達水平顯著上調(P<0.05)。

分析ACTH處理對母豬肝中糖酵解相關酶類mRNA表達的影響，結果如圖4所示。母豬肝中磷酸果糖激酶(PFKL)、丙酮酸激酶(PKLR)、己糖激酶1(HK1)和己糖激酶3(HK3)的mRNA表達水平在兩組間差異不顯著(P>0.05)。但是，處理組母豬肝中己糖激酶2(HK2) mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。

分析ACTH處理對母豬肝中糖原合成、分解及戊糖磷酸途徑相關酶類mRNA表達的影響，結果如圖5所示。與對照組相比，處理組母豬肝中糖原合成酶1(GYS1)、糖原磷酸化酶(PYGL)及6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)的mRNA表達水平呈上升趨勢，但兩組間差異均不顯著(P>0.05)。

2.3 ACTH處理對母豬肝中葡萄糖代謝相關酶活性的影響

ACTH處理對母豬肝中葡萄糖代謝相關酶類活性的影響如圖6所示。處理組母豬肝中丙酮酸羧化酶(PC)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)的活性與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。處理組母豬肝中葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)的活性顯著高于對照組(P<0.05)，磷酸果糖激酶(PFKL)的活性顯著低于對照組(P<0.05)。此外，丙酮酸激酶(PKLR)、己糖激酶(HK)、糖原合成酶(GYS)、糖原磷酸化酶(PYGL)及6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)活性在兩組間的差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 ACTH處理對母豬血糖水平的影響
Fig.2 Effects of ACTH-treatment on levels of glucose in the blood of sows

2.4 ACTH處理對母豬肝中糖皮質激素受體mRNA表達的影響

檢測處理組與對照組母豬肝中糖皮質激素受體(GR) mRNA的表達水平，結果顯示,處理組GR水平呈上調趨勢，但兩組間差異不顯著(P>0.05)(圖7)。

3 討 論

本試驗通過對母豬注射促腎上腺皮質激素(ACTH)模擬應激發生，分析應激對母豬肝血糖調控的影響機制。試驗第1天，處理組皮質醇濃度急劇升高，隨著試驗持續進行，皮質醇濃度略有下降，這可能與皮質醇對HPA軸的反饋調節有關。對照組皮質醇濃度保持平穩，說明注射處理本身沒有對動物造成應激反應。試驗期間處理組母豬皮質醇濃度一直顯著高于對照組，且處理組血糖水平明顯高于對照組，均反映處理組母豬處于應激狀態，應激模型建立成功。

血糖是體內代謝過程中的重要物質，與部分血脂指標及脂肪沉積性狀存在顯著相關性[24]，可以反映機體能量變化。肝糖異生是肝糖代謝的重要組成部分，機體近一半葡萄糖的供應依賴于糖異生作用[25]。糖異生的速度與編碼糖異生途徑限速酶的基因表達有關[26-27]。本試驗中，處理組肝母豬肝中糖異生途徑的關鍵酶葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1、PCK2)的mRNA表達水平均上調，且葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)的酶活性明顯上升，表明ACTH處理引起的高濃度皮質醇可能通過糖異生途徑中的限速酶葡萄糖-6-磷酸酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶加速肝中糖異生速度，提高血液中葡萄糖濃度。糖酵解是機體內分解葡萄糖供能的必經途徑，酵解過程有3步反應為不可逆反應，催化這3步反應的酶是己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，其中磷酸果糖激酶是糖酵解反應的限速酶[28-30]。

圖3 ACTH處理對母豬肝糖異生相關酶類mRNA表達的影響
Fig.3 Effects of ACTH-treatment on mRNA expression of enzymes related to gluconeogenesis in the liver of sows

圖4 ACTH處理對母豬肝糖酵解相關酶類mRNA表達的影響
Fig.4 Effects of ACTH-treatment on mRNA expression of enzymes related to glycolysis in the liver of sows

圖5 ACTH處理對母豬肝糖原合成、分解及戊糖磷酸途徑相關酶類mRNA表達的影響
Fig.5 Effects of ACTH-treatment on mRNA expression of enzymes related to glycogen synthesis, breakdown and pentose phosphate pathway in the liver of sows

圖6 ACTH處理對母豬肝中葡萄糖代謝相關酶活性的影響
Fig.6 Effects of ACTH-treatment on activity of enzymes related to glucose metabolism in the liver of sows

圖7 ACTH處理對母豬肝中糖皮質激素受體mRNA表達的影響
Fig.7 Effects of ACTH-treatment on mRNA expression of glucocorticoid receptor in the liver of sows

本試驗中，處理組肝己糖激酶2(HK2)mRNA表達上調；己糖激酶1(HK1)、丙酮酸激酶(PKLR)的mRNA表達水平呈下調趨勢。在正常生理狀態下，低濃度血糖會激起肝中丙酮酸激酶的磷酸化，使其活性降低，降低肝中葡萄糖的利用[31]。本研究中，ACTH處理下調丙酮酸激酶的轉錄表達，降低磷酸果糖激酶的酶活性，暗示應激抑制豬肝中的糖酵解，進而抑制肝中葡萄糖的利用。糖原是葡萄糖的一種高效能的貯存形式，糖原的存在保證了機體最需能量供應的腦和肌肉緊張活動時對能量的需要，同時也保證不間斷地供給恒定水平的血糖[32-33]。肝是機體貯存糖原的器官，本研究中，ACTH處理沒有顯著影響肝中糖原合成酶1(GYS1)的mRNA表達，此外參與糖原分解的糖原磷酸化酶(PYGL)及參與磷酸戊糖途徑的關鍵酶6-磷 酸葡萄糖脫氫酶(G6PD) 的mRNA表達均未發生顯著變化，暗示ACTH處理未影響肝中糖原合成、糖原分解及磷酸戊糖途徑。

皮質醇主要通過與糖皮質激素受體結合發揮其生物學作用[34-35]，為分析ACTH處理是否影響母豬肝中糖皮質激素受體GR的表達，本研究分析了兩組母豬肝中糖皮質激素受體mRNA的表達差異，結果顯示，處理組豬肝中糖皮質激素受體水平呈上調趨勢，但差異未達顯著水平；這一結果暗示，ACTH處理對母豬肝中糖代謝相關酶類轉錄活性的影響可能依賴于GR之外的其它途徑，具體機制仍需要進一步研究探討。

4 結 論

本試驗通過ACTH處理模擬豬生產中應激的發生，致使母豬皮質醇濃度升高，其導致血糖水平升高的可能作用機制：一方面通過上調肝中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶基因的轉錄表達，增強糖異生作用；另一方面，通過下調肝中磷酸果糖激酶的活性，抑制糖酵解反應，降低葡萄糖利用。但ACTH處理不影響肝中磷酸戊糖途徑、糖原合成及分解；且ACTH處理未影響母豬肝中糖皮質激素受體的轉錄表達，提示ACTH處理對母豬肝中糖代謝相關酶類轉錄活性的影響可能依賴于GR之外的其它途徑。