釀酒酵母β-葡聚糖對綿羊瘤胃上皮細胞β-防御素-1表達的影響

張 曼，金 鑫，王云鶴，魏 方，溫婧怡，李政憶，楊銀鳳*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點試驗室，呼和浩特 010018)

防御素(defensins)是具有兩親性和陽離子性質(zhì)的小半胱氨酸肽家族，被認為是構(gòu)成最初和有效的宿主防御系統(tǒng)的一部分，其廣泛存在于植物、昆蟲和脊椎動物中[1-2]。防御素基于半胱氨酸殘基之間分子內(nèi)二硫鍵形成的模式分為3類：α-、β-和θ-防御素[3]。β-防 御素是一種由38～42個氨基酸組成，且存在于許多脊椎動物體內(nèi)的陽離子抗菌肽[4]，其在先天和適應(yīng)性免疫方面起著關(guān)鍵作用，能夠殺死各種病原體，包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲。此外，β-防 御素還是免疫細胞的趨化性引誘劑，能夠參與免疫調(diào)節(jié)[5]。

β-葡聚糖是一種廣泛存在于細菌、真菌、藻類和植物細胞壁中的多糖，其因能夠增強免疫力、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、促進傷口愈合以及刺激先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)而備受關(guān)注[6-8]。近年來一些研究表明，β-葡聚糖可以通過促進人和魚類白細胞介素、防御素和cathelicidins的分泌，從而對侵入機體內(nèi)的微生物起到防御功能[9-13]。然而，關(guān)于釀酒酵母細胞壁成分β-葡聚糖對反芻動物RECs防御素表達影響的研究尚未見相關(guān)報道。

本試驗采用qPCR和ELISA方法檢測β-葡聚糖在不同濃度、不同時間段刺激RECs后SBD-1 mRNA和蛋白的表達變化。為今后了解β-葡聚糖與上皮細胞防御素表達的關(guān)系，解析防御素發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的途徑和機制提供一定的理論基礎(chǔ)及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物來自呼和浩特市北亞屠宰場健康狀況良好的綿羊。綿羊屠宰后立刻剪取一塊內(nèi)表面乳頭較大且較密的瘤胃組織，用生理鹽水沖洗干凈后放入PBS中備用。

1.2 綿羊RECs原代培養(yǎng)

根據(jù)金鑫等[14]報道的綿羊RECs培養(yǎng)方法進行綿羊RECs的原代培養(yǎng)，鈍性分離瘤胃組織的漿膜和肌層，將分離后的黏膜層經(jīng)0.25% 胰蛋白酶在37 ℃溫箱消后化，將后4次收集得到的細胞加入含體積分數(shù)20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，過濾、離心、分裝，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細胞在培養(yǎng)瓶中達到80%～100%傳代培養(yǎng)后，用不含有兩性霉素和其他抗生素的細胞培養(yǎng)基37 ℃，5% CO2孵育過夜，用于后續(xù)刺激試驗。

1.3 β-葡聚糖刺激綿羊RECs的條件優(yōu)化

用不同濃度(0、5、10、20、50、100 μg·mL-1)的β-葡聚糖(Sigma-Aldrich)刺激RECs，37 ℃，5% CO2孵育8 h。然后通過qPCR和ELISA方法檢測SBD-1 mRNA和蛋白的表達量，以選取β-葡聚糖刺激SBD-1表達的最佳濃度；用最佳的β-葡聚糖濃度分別刺激RECs 0、2、4、8、12、24 h，然后通過qPCR和ELISA方法檢測SBD-1 mRNA和蛋白的表達量，以選取β-葡聚糖刺激SBD-1表達的最佳時間。

1.4 引物設(shè)計

本研究中β-actin為內(nèi)參基因，SBD-1為所要檢測的目的基因。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計和合成(表1)。

表1引物序列

Table1Primersequences

基因名稱Gene nameGenBank登錄號GenBank accession No.片段大小/bpFragment size引物序列(5′→3′)Primer pair sequenceβ-actinU39357208F: GTCACCAACTGGGACGACAR: AGGCGTACAGGGACAGCASBD-1U75250133F:GCTCTTCTTCGTGGTCCTGTR: ACAGGTGCCAATCTGTCTCA

1.5 綿羊RECs總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

綿羊RECs總RNA的提取按照RNA提取試劑盒(Axygen Scientific, Inc. USA)進行操作，并使用Synergy H4 Hybrid酶標(biāo)儀(BioTek Inc，Winooski，VT，USA)測量260和280 nm處的吸光度來分析總RNA濃度和純度，將OD260 nm/OD280 nm比值在1.9～2.0范圍內(nèi)的樣品按照TaKaRa的去除基因組DNA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，Japan)進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將得到的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 綿羊SBD-1 mRNA的實時熒光定量PCR(qPCR)

內(nèi)參基因β-actin和目的基因SBD-1的qPCR測定在QuantStudioTM7 Flex Real-time PCR System儀器(Thermo Fisher Scientific)上進行。每20 μL 反應(yīng)物含有SYBR Premin Ex Taq(2×)10 μL，正向和反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序為擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，45個循環(huán)；熔解程序：95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，每個樣品分別做5個重復(fù)。使用2-ΔΔCt方法計算mRNA的相對表達量。

1.7 綿羊SBD-1蛋白的ELISA檢測

收集不同濃度的β-葡聚糖處理組以及同濃度刺激0、2、4、8、12和24 h后的共培養(yǎng)上清，采用綿羊防御素β1(DEFβ1)ELISA試劑盒，按其說明進行操作，然后用Synergy H4 Hybrid酶標(biāo)儀(BioTek Inc，Winooski，VT，USA)測定各樣品OD值(450 nm)，并運用EXCEL(2007)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 綿羊RECs的活力鑒定

將RECs以2×104個·孔-1的密度接種在96孔板。用不同濃度(0、5、10、20、50和100 μg·mL-1)的β-葡聚糖(Sigma-Aldrich)刺激RECs 8 h，以及用誘導(dǎo)SBD-1表達最高的β-葡聚糖濃度刺激瘤胃上皮0、2、4、8、12和24 h，同時單獨培養(yǎng)的細胞作為空白對照。將100 μL DMEM/F12培養(yǎng)基和10 μL MTT(Sigma-Aldrich)加入到每個孔中，并在37 ℃，5% CO2孵育4 h后用DMSO溶解。使用酶標(biāo)儀在540 nm下測定孔的密度。

1.9 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism5軟件繪制圖片。所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way，ANOVA)，多重比較采用最小顯著性差異法(least-significant difference，LSD)。所有數(shù)據(jù)表示為至少5個獨立試驗的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。統(tǒng)計學(xué)顯著性設(shè)定在P< 0.05水平。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊RECs的傳代培養(yǎng)

綿羊RECs傳代細胞生長迅速，培養(yǎng)2 d后，細胞形態(tài)清晰，呈鵝卵石鋪路狀(圖1A)；培養(yǎng)4 d后，細胞即有90%以上聚集生長，鏡下觀察基本沒有空余位置，形成漩渦狀排列的致密單層細胞集落，且細胞界限明顯，可以進行后續(xù)試驗(圖1B)。

2.2 綿羊qPCR擴增產(chǎn)物SBD-1的特異性檢測

以β-actin為內(nèi)參基因，SBD-1為目的基因，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA經(jīng)qPCR擴增反應(yīng)，擴增曲線表明，擴增效果良好(圖2A, 2B)，經(jīng)熔解曲線分析，β-actin和SBD-1分別在88.5和84 ℃出現(xiàn)單一峰，均沒有出現(xiàn)雜峰，并且主峰(熔解峰)對應(yīng)的Tm值與引物設(shè)計后預(yù)期產(chǎn)物Tm值相同(圖3A, 3B)，說明qPCR的擴增產(chǎn)物為單一的具有特異性的產(chǎn)物。

2.3 綿羊qPCR擴增產(chǎn)物SBD-1的瓊脂糖凝膠電泳分析

將qPCR擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，在約208和133 bp位置處可見各有一條特異性條帶，與引物設(shè)計預(yù)期的片段大小相一致，擴增產(chǎn)物條帶整齊且無二聚體形成，表明qPCR產(chǎn)物分別為β-actin和SBD-1的基因產(chǎn)物(圖4)。

A. 傳代培養(yǎng)2 d的綿羊RECs；B. 傳代培養(yǎng)4 d的綿羊RECs
A. The ovine ruminal epithelial cells after 2 days subculture； B. The ovine ruminal epithelial cells after 4 days subculture
圖1 綿羊RECs的傳代培養(yǎng)(100×)
Fig.1 Subcultures of ovine ruminal epithelial cells (100×)

A. β-actin基因的擴增曲線；B. SBD-1基因的擴增曲線
A. The amplification curve of β-actin gene； B. The amplification curve of SBD-1 gene
圖2 β-actin和SBD-1基因的擴增曲線
Fig.2 The amplification curves of β-actin and SBD-1 genes

A. β-actin熔解曲線；B. SBD-1熔解曲線
A. The melt peak curve of β-actin gene; B. The melt peak curve of SBD-1 gene
圖3 β-actin和SBD-1的熔解曲線
Fig.3 The melt peak curves of β-actin and SBD-1 genes

圖4 β-actin和SBD-1基因qPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖
Fig.4 The agarose gel electrophoresis of amplified products of β-actin and SBD-1 by qPCR

2.4 β-葡聚糖刺激綿羊RECs對SBD-1 mRNA表達的影響

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0分析，結(jié)果如圖5所示，用不同濃度的β-葡聚糖(5、10、20、50和100 μg·mL-1)刺激RECs 8 h后，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖能夠誘導(dǎo)SBD-1 mRNA的表達，且當(dāng)β-葡聚糖濃度為10 μg·mL-1時SBD-1的表達量極顯著高于對照組(P<0.01)，而當(dāng)β-葡聚糖的濃度為100 μg·mL-1刺激

RECs時，發(fā)現(xiàn)SBD-1 mRNA的表達量顯著降低，但仍顯著高于空白對照組(P< 0.05，圖5A)。接下來用10 μg·mL-1的β-葡聚糖刺激RECs 0、2、4、8、12和24 h后，與空白對照組相比，β-葡聚糖刺激2 h后觀察到SBD-1的表達量達到最高(P<0.01， 圖5B)。 因此，當(dāng)濃度為10 μg·mL-1的β-葡聚糖刺激RECs 2 h后SBD-1 mRNA的表達量達到最高。

A.β-葡聚糖不同刺激濃度對SBD-1 mRNA表達的影響；B. β-葡聚糖不同刺激時間對SBD-1 mRNA表達的影響。*. P<0.05；**. P<0.01，下圖同
A.Effects of different concentrations of β-glucan on SBD-1 mRNA expression; B. Effects of β-glucan stimulated RECs at different times on SBD-1 mRNA expression. *. P < 0.05; **. P < 0.01, the same as the following figures
圖5 β-葡聚糖對綿羊RECs SBD-1 mRNA表達的影響
Fig.5 Effect of β-glucan on the expression of sheep RECs SBD-1 mRNA

2.5 β-葡聚糖刺激綿羊RECs對SBD-1蛋白表達的影響

標(biāo)準(zhǔn)曲線的二次多項式擬合方程為y=ax2+bx+c(其中a=2 656.3，b=3 185.5，c=-249.72)，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 3，表明樣品濃度可以利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計算(圖6)。

圖6 ELISA試驗標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.6 Standard curve of ELISA test

ELISA結(jié)果表明，SBD-1在蛋白水平的表達趨勢與mRNA水平相似。用不同濃度的β-葡聚糖(5、10、20、50和100 μg·mL-1)刺激綿羊RECs后檢測SBD-1的蛋白表達情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，用10 μg·mL-1的β-葡聚糖刺激RECs后極顯著增加了RECs中SBD-1的蛋白表達(P<0.01，圖7A)。接下來，用10 μg·mL-1的β-葡聚糖刺激RECs 0～24 h后檢測發(fā)現(xiàn)，SBD-1蛋白的表達最大刺激時間為4 h(P<0.01，圖7B)。這表明，β-葡聚糖刺激RECs后均能提高共培養(yǎng)上清中SBD-1的蛋白表達，且當(dāng)濃度10 μg·mL-1刺激4 h SBD-1的蛋白表達達到峰值。

A.β-葡聚糖不同刺激濃度對SBD-1蛋白表達的影響；B. β-葡聚糖不同刺激時間對SBD-1蛋白表達的影響
A. Effects of different concentrations of β-glucan on SBD-1 protein expression; B. Effects of β-glucan stimulated RECs at different times on SBD-1 protein expression
圖7 β-葡聚糖對綿羊RECs SBD-1蛋白表達的影響
Fig.7 Effect of β-glucan on the expression of sheep RECs SBD-1 protein

2.6 β-葡聚糖刺激綿羊RECs的不同濃度和時間對上皮細胞存活率的影響

為了確定β-葡聚糖可能的毒性，本研究用不同濃度β-葡聚糖(5、10、20、50和100 μg·mL-1)刺激RECs 8 h。使用MTT測定法檢測β-葡聚糖刺激RECs后上皮細胞的存活率。觀察到在RECs中β-葡 聚糖濃度為5、10、20、50 μg·mL-1(P> 0.05)對RECs沒有毒性，而濃度為100 μg·mL-1時發(fā)現(xiàn)顯著的細胞死亡(P< 0.05，圖8A)。而后，用10 μg·mL-1的β-葡聚糖刺激RECs 0～24 h后，觀察到β-葡聚糖濃度為10 μg·mL-1刺激RECs 0～24 h的細胞均存活(P> 0.05，圖8B)。

3 討 論

長期以來，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中抗生素一直被用于預(yù)防動物疾病和促進動物的生長[15]。然而，由于細菌對抗生素耐藥性負面影響的不斷增加[16]，抗生素替代品的開發(fā)已成為研究的新熱點，而防御素被認為是抗生素的潛在替代品之一。

A.β-葡聚糖不同刺激濃度對綿羊RECs活性影響; B. β-葡聚糖不同刺激時間對綿羊RECs活性影響
A. Effects of different concentrations of β-glucan on the activity of sheep RECs; B. Effect of β-glucan stimulated RECs at different times on the activity of sheep RECs
圖8 β-葡聚糖刺激綿羊RECs后細胞活性檢測
Fig.8 The sheep ruminal epthelial cell viability after β-glucan treatment

以往的研究表明，益生菌、維生素D3、丁酸、膽汁酸和維甲酸可以誘導(dǎo)反芻動物、人或家禽體內(nèi)宿主防御肽(host defence peptides，HDPs)的表達，并增強機體對疾病的抵抗力[17-20]。因此，通過飲食調(diào)節(jié)來誘導(dǎo)內(nèi)源性HDPs的表達是一種用于控制和預(yù)防疾病的新型抗微生物方法。而酵母β-葡聚糖是一種從釀酒酵母細胞壁中提取的多糖，已被廣泛研究，并被證明具有涉及受體識別的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠最有效地增強哺乳動物物種中的宿主先天性免疫反應(yīng)[21-24]。

盡管許多多糖被證明是參與激活宿主防御機制的成分，但有關(guān)釀酒酵母細胞壁成分β-葡聚糖與先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的抗微生物肽防御素的表達關(guān)系仍少見報導(dǎo)。Van Der Marel等[12]和Schmitt等[13]的研究結(jié)果表明，在魚飲食中補充一定劑量的酵母聚糖能夠促進鰓中β-防御素-2和皮膚中β-防御素基因的表達以及腸上皮細胞中防御素和cathelicidins的分泌。同樣，Campoverde等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在大西洋白姑魚體內(nèi)注射β-葡聚糖24 h后，腎中β-防御素的表達顯著上調(diào)，而在體外培養(yǎng)的腎和腸細胞中與β-葡聚糖分別共培養(yǎng)4或24 h后β-防御素的表達增加，之后呈下降趨勢。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖以劑量和時間依賴方式誘導(dǎo)SBD-1 mRNA和蛋白的表達，并且低濃度的β-葡聚糖(10 μg·mL-1) 刺激RECs 2或4 h就能有效誘導(dǎo)SBD-1的表達量達到最高，而后呈下降趨勢。說明利用釀酒酵母細胞壁成分β-葡聚糖作為誘導(dǎo)劑，特異性誘導(dǎo)β-防御素在RECs內(nèi)的高效表達具有可行性，且β-葡聚糖對機體的誘導(dǎo)效果可能取決于作用的劑量和時間，太低的劑量或刺激時間較短誘導(dǎo)效果不明顯，而太高的劑量或刺激時間較長具有抑制作用。由此提示，在一定濃度和時間范圍內(nèi)，β-葡聚糖在RECs上誘導(dǎo)SBD-1的表達過程可能是機體自身的一種調(diào)節(jié)過程，即當(dāng)用β-葡聚糖刺激RECs后SBD-1的表達量升高，但達到最高時機體也會隨著刺激時間的延長逐漸將SBD-1的表達量調(diào)節(jié)到自身基礎(chǔ)水平，從而保持SBD-1表達的穩(wěn)態(tài)。

另有研究表明，益生菌分子與宿主的相互作用可能是益生菌發(fā)揮益生效應(yīng)的基礎(chǔ)，如革蘭氏陽性細菌的主要細胞壁成分肽聚糖和脂磷壁酸，革蘭氏陰性細菌的主要細胞壁成分脂多糖，均被認為是免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵組分[26-29]，而本研究中證明的釀酒酵母菌細胞壁成分β-葡聚糖能夠誘導(dǎo)SBD-1的表達，同樣也可猜測為β-葡聚糖在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，但是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究利用體外培養(yǎng)的綿羊RECs，從mRNA和蛋白質(zhì)水平證明了釀酒酵母菌一個主要的細胞壁成分β-葡聚糖能夠上調(diào)綿羊RECsSBD-1基因的表達，且β-葡聚糖濃度為10 μg·mL-1分別刺激RECs 2和4 h后SBD-1 mRNA和蛋白的表達水平達到最高，此結(jié)果為今后β-葡聚糖制劑添加于飼料中最佳的添加比例和飼喂間隔時間提供理論依據(jù)。