Novel_miR218對山羊外周血單核細胞中SLAM受體表達的影響

宋華杰，王 婷，李 珍，王晶鈺，齊雪峰

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起山羊、綿羊及野生小反芻獸的一種急性、烈性、接觸性動物傳染病。該病至今依然是世界范圍內嚴重威脅動物健康養殖的重大疫病之一。PPRV對淋巴細胞和上皮細胞具有較強噬性，其感染宿主后造成機體免疫抑制是其致病的主要特征[1]。雖然目前對于PPRV已經做了很多有價值的研究工作，但關于該病毒對山羊致病機制研究仍不十分明了。淋巴細胞信號活化分子(signaling lymphocyte activation molecule，SLAM)表達于多種哺乳動物淋巴細胞、樹突細胞及巨噬細胞等，是PPRV等麻疹病毒屬病毒在淋巴細胞的主要受體[2-6]。山羊的外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)被廣泛用于小反芻獸疫病毒致免疫抑制相關研究。研究表明，山羊PBMCs中SLAM受體表達水平與PPRV的增殖水平密切相關[4,7]，而有關SLAM受體表達調節機制及其在PPRV感染與復制中的具體作用尚不完全清楚。

近年來，越來越多的證據表明宿主細胞小RNA(miRNA)是機體先天性/獲得性免疫以及宿主-病原體相互作用的復雜網絡中不可或缺的調節因子，其在抗病毒感染和復制方面發揮著重要作用[8-10]。Novel_miR218是本實驗室在山羊PBMCs中新發現的一種微小核糖核酸分子，基于RNAhybrid及miRanda等生物信息學分析表明SLAM是novel_miR218的潛在靶基因，但關于novel_miR218對山羊PBMCs中SLAM表達水平調節機制尚需進一步證實。

本研究旨在研究novel_miR218在PPRV感染山羊PBMCs中對SLAM受體表達水平的調節作用及其對病毒增殖的影響，研究結果對進一步闡明PPRV在羊源細胞中的復制及其致病機制具有重要的理論意義和潛在的應用價值。

1 材料與方法

1.1 病毒及細胞

所用PPRV標準疫苗毒株N75-1為筆者實驗室保存，病毒在Vero細胞上增殖，滴度是105.65TCID50·mL-1；山羊PBMCs從西北農林科技大學實驗動物中心18月齡健康莎能奶山羊頸靜脈處無菌采血，隨后用淋巴細胞分離液分離獲得，通過含有100單位的青霉素、100 μg·mL-1的鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養。

1.2 主要試劑

DMEM/F-12為Gibco產品；胎牛血清為Hyclone產品；胰蛋白酶為Amresco產品；Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑、RNA酶抑制劑和TRIzol RNA試劑盒均為Invitrogen公司產品；逆轉錄試劑盒和miRNA定量試劑盒均為廣州銳博生物科技有限公司產品；鼠抗SLAM單克隆抗體、兔抗β-actin抗體、HRP-羊抗兔IgG和HRP-羊抗鼠IgG均購自Invitrogen公司；鼠抗PPRV N蛋白抗體由中國獸醫藥品監察所提供。

1.3 引物設計與合成

參照NCBI公布的山羊SLAM基因序列設計引物，其正向引物序列：5′-AACTGGAGTGAGGAAGCAGGT-3′，反向引物序列：5′-CGCAATGCAGATGTAGACGTT-3′；內參β-actin的正向引物序列：5′-GCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3′，反向引物序列：5′-CTCCTTGGAGGCCATGTGGACCATG-3′。Novel_miR218序列信息為5′-CUCCCAGCGCUGUCACCAC-3′，其定量PCR引物序列購自廣州銳博生物科技有限公司(產品編號:miR8003168、miR8003167)。

1.4 Novel_miR218 mimic及inhibitor序列

Novel_miR218模擬物(novel_miR218 mimic)、novel_miR218拮抗物(novel_miR218 inhibitor)均購自廣州銳博生物科技有限公司(產品編號:miR1170901031458、miR2170901031600)。

1.5 病毒感染

山羊PBMCs分離后在5%CO2濃度的培養箱、10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中培養16 h。未貼壁的山羊PBMCs在病毒接種前用RPMI 1640培養基輕輕洗去。之后用MOI=1的PPRV N75-1株病毒接種山羊PBMCs，同時設置未感染對照，于感染后24 h(hpi)收樣。感染組和未感染對照組均設置3個獨立的生物學重復。

1.6 RNA的提取和熒光定量PCR

用TRIzol reagent處理各組PBMCs后提取總RNA，Nanodrop2000超微量分光光度計定量，用cDNA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，采用SYBR GreenⅠ法進行qRT-PCR，每組3個重復，檢測PPRV感染山羊PBMCs中SLAMmRNA和novel_miR218的表達水平變化。SLAMmRNA和novel_miR218檢測分別以β-actin和5S為內參基因，2-ΔΔCt法進行相對定量計算，每個樣品重復3次求平均值。

1.7 Western blot檢測

將作用不同時間段的各組細胞用RIPA裂解后進行SDS-PAGE，然后將蛋白質電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別用SLAM抗體、PPRV N蛋白抗體、β-actin抗體在4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4次，二抗孵育1 h，TBST洗膜6次，加入化學發光劑ECL，曝光獲得相應條帶，采用ImageJ2x 軟件分析灰度值。

1.8 轉染novel_miR218的模擬物和拮抗物

按照Invitrogen公司提供Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑說明書，分別將novel_miR218模擬物(novel_miR218 mimic)、novel_miR218 拮抗物(novel_miR218 inhibitor)及相應的對照miRNA轉染入細胞中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育48 h；之后分別于各孔接種1.0 MOI值PPRV，于37 ℃培養24 h；通過Western blot檢測轉染細胞中SLAM和PPRV N蛋白的表達水平。每個試驗設3個重復，同時設定對照組。

1.9 數據處理與統計

2 結 果

2.1 PPRV在山羊PBMCs中的增殖規律

在PPRV感染山羊PBMCs后不同時間，通過觀察細胞CPE及檢測病毒N蛋白的表達量明確了PPRV N75-1毒株在山羊PBMCs中的復制規律。與對照組相比，PPRV感染細胞可見細胞腫脹、聚集及脫落等細胞病變，且隨著感染時間延長細胞病變越來越明顯(圖1)。Western blot結果顯示，PPRV N蛋白的表達水平在24 hpi時明顯增加且隨著感染時間延長而不斷升高(圖2)。PPRV感染山羊PBMCs中SLAM蛋白的表達水平檢測表明，在24和48 hpi時SLAM表達水平較0 hpi時極顯著增加(P<0.01)，而在72和96 hpi時表達水平降低(圖2)。

圖1 PPRV感染山羊PBMCs后的細胞病變
Fig.1 CPE of PPRV-infected goat PBMCs

與對照組(0 hpi)比較，*.P<0.05; **.P<0.01
Compared with control (0 hpi), *.P<0.05; **.P<0.01
圖2 Western blot檢測PPRV感染山羊PBMCs中相關蛋白的表達
Fig.2 Western blot analysis of protein relative expression of PPRV-infected goat PBMCs

2.2 qRT-PCR檢測SLAM mRNA和novel_miR218表達水平

PPRV感染山羊PBMCs中SLAMmRNA和novel_miR218的qRT-PCR檢測結果表明， 24 hpi時SLAMmRNA表達水平較0 hpi極顯著增加(P<0.01)，隨后逐漸降低；對照組SLAMmRNA表達水平在各檢測時間點均較低(圖3)。Novel_miR218表達水平變化趨勢則與SLAMmRNA呈負相關，24 hpi時novel_miR218表達水平較0 hpi極顯著降低(P<0.01)，隨后逐漸升高；在24～96 hpi，PPRV感染組novel_miR218表達水平均顯著低于同時間點對照組(圖4)。

與對照組(0 hpi)比較，*.P<0.05; **.P<0.01
Compared with control (0 hpi), *.P<0.05; **.P<0.01
圖3 qRT-PCR檢測PPRV感染山羊PBMCs后SLAM mRNA水平
Fig.3 qRT-PCR analysis of SLAM mRNA expression fold of PPRV-infected goat PBMCs

與對照組(0 hpi)比較，*.P<0.05; **.P<0.01
Compared with control(0 hpi), *.P<0.05; **.P<0.01
圖4 qRT-PCR檢測PPRV感染山羊PBMCs后novel_miR218水平
Fig.4 qRT-PCR analysis of novel_miR218 expression fold of PPRV-infected goat PBMCs

2.3 轉染novel_miR218模擬物和拮抗物對SLAM和PPRV N蛋白的影響

如圖5所示，novel_miR218 mimic轉染組中SLAM和PPRV-N蛋白表達水平均較轉染對照組降低(P<0.05 或P<0.01)，且呈轉染濃度依賴性；相反地(圖6)，novel_miR218 inhibitor轉染組中SLAM和PPRV-N蛋白表達水平均較對照組呈轉染濃度依賴性升高(P<0.05或P<0.01)。表明novel_miR218對SLAM受體的蛋白表達具有明顯負調控作用，同時影響PPRV的增殖水平。

與對照組(MC)比較，*.P<0.05;**.P<0.01
Compared with control(MC), *.P<0.05; **.P<0.01
圖5 Western blot檢測轉染novel_miR218 mimic后PPRV感染山羊PBMCs中相關蛋白表達水平
Fig.5 Western blot analysis of protein relative expression after the transfection of novel_miR218 mimic into PPRV-infected goat PBMCs

與對照組(IC)比較，*.P<0.05; **.P<0.01
Compared with control(IC), *.P<0.05; **.P<0.01
圖6 Western blot檢測轉染novel_miR218 inhibitor后PPRV感染山羊PBMCs中相關蛋白表達水平
Fig.6 Western blot analysis of protein relative expression after the transfection of novel_miR218 inhibitor into PPRV-infected goat PBMCs

3 討 論

小反芻獸疫是由副黏病毒科麻疹病毒屬小反芻獸疫病毒(PPRV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性一類傳染病，主要感染包括野生動物在內的小反芻動物，其中山羊高度易感，綿羊易感。該病危害嚴重，其發病率可高達90%～100%，病死率可達50%～100%[11-13]。 與其他病毒一樣，PPRV侵染宿主細胞的“核心”機制是病毒與特定受體結合進而感染宿主細胞[14-15]。然而，PPRV對感染宿主的致病機制尚不十分明了，特別是在山羊等高度易感動物。現已確定PPRV的天然受體有兩個：SLAM和脊髓灰質炎病毒受體(Nectin4/PVRL4)。其中SLAM僅僅在T淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞和樹突狀細胞等免疫細胞表面表達，Nectin4則主要在上皮細胞中表達[16-18]。SLAM是PPRV感染宿主并致病的關鍵受體，當PPRV通過呼吸道途徑侵染宿主時，它首先與巨噬細胞和樹突狀細胞表面SLAM受體發生結合并相互作用，而后被轉運到局部淋巴結進行增殖擴散[19-23]。PPRV的N結構蛋白被廣泛用于對PPRV增殖規律的研究[15,23-24]。2008年，Pawar等[4,24]在通過siRNA干擾技術證實SLAM是PPRV感染的病毒受體的基礎上，進一步研究發現山羊外周血單核細胞中SLAM的表達水平與PPRV復制具有很高的相關性，不同表達水平的SLAMmRNA影響病毒的復制和滴度。然而，目前對于SLAM表達水平的調控機制尚不清楚。

越來越多的研究表明[25-26]，miRNAs與病毒的感染和致病有密切聯系，發揮著重要功能。在麻疹病毒屬的研究表明[27-28]，麻疹病毒感染可導致宿主細胞中miRNA表達譜及其相應的靶基因mRNA表達發生顯著變化。此外，Geekiyanage和Galanis[29]研究表明，miR-31和miR-128可通過調控麻疹病毒在腫瘤細胞的受體Nectin4，進而調控該病毒對該細胞的易感性。本實驗室在對PPRV感染山羊PBMCs中miRNA表達譜進行差異分析表明，novel_miR218有可能對SLAM受體的表達具有一定調節作用。本研究中通過檢測PPRV感染山羊PBMCs不同時間后SLAM和novel_miR218表達水平發現，novel_miR218表達水平變化趨勢與SLAMmRNA呈負相關，而轉染novel_miR218 mimic后SLAM和PPRV-N蛋白表達水平均較轉染對照組降低，轉染novel_miR218 inhibitor后SLAM和PPRV-N蛋白表達水平均較轉染對照組升高，以上結果表明novel_miR218對SLAM受體的蛋白表達具有明顯負調控作用。因此PPRV在早期侵染過程中，可能通過novel_miR218介導對SLAM受體表達豐度的調控，進而影響PPRV在山羊PBMCs中的增殖水平。另外，本研究結果是否與PBMCs分離山羊種屬、性別等有關有待進一步研究。現已證實，除了麻疹病毒屬病毒外，其他多種病毒及致病菌也均以SLAM蛋白作為其在宿主細胞的感染受體并通過調控該受體表達水平進而達到免疫逃逸[30]。因此，關于SLAM受體表達及其相關信號通路調控研究對深入了解相關病原體致病機制具有重要意義。

4 結 論

PPRV感染山羊PBMCs中SLAM受體表達水平與novel_miR218的表達水平呈負相關，其中SLAM受體表達呈先升高后降低趨勢，而novel_miR218的表達呈先降低后升高趨勢；山羊PBMCs源novel_miR218對SLAM受體表達具有負調控作用并對PPRV增殖水平有一定影響。本項目研究結果對進一步闡明PPRV在羊源細胞中的復制及其致病機制等均具有重要的理論意義和潛在的應用價值。