破血化瘀湯治療急性腦內血腫大鼠療效及其對VEGF、GAP-43影響的研究*

周漢光，張建黨，張元峰，曹阿丹

1.河南省南陽市中心醫院神經外科(南陽 473000)，2.河南科技大學第二附屬醫院影像科 (洛陽 471000)

主題詞 血腫 @破血化瘀湯 動物實驗 大鼠

隨著社會水平的提高和交通運輸業的發展，外傷造成的顱腦損傷發生率僅次于四肢傷，在全身損傷中高達15%，其中以腦內血腫最為常見[1-2]。急性腦內血腫是指腦實質內的血腫，可發生在腦組織的任何部位，好發于額葉及顳葉前端，占總數的80%，其次是頂葉和枕葉約占10%左右，其余則分別位于腦深部、腦基底節、腦干及小腦內等處[3-5]。顱腦損傷后，血腫迅速形成，隨著出血繼續，血腫不斷擴大，進而推移、壓迫腦組織，導致顱內壓升高和腦疝形成，從而引發一系列臨床癥狀[6]。該病具有損傷部位嚴重、發病迅速、預后不良的特點。西醫對腦出血的治療主要采取保守的內科治療，如脫水降顱內壓，控制水腫，調整血壓等，大劑量出血采取手術消除血腫，而中醫藥對本病在預防治療和康復方面有良好的療效與優勢。中醫理論中提出“離經之血便是瘀”一說，所以對急性腦出血提出了破血化瘀的治療法則，臨床上取得了較好的療效，但是對其作用機制的研究尚缺乏理論支持，有必要進行實驗研究。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前發現的刺激血管生成的因子之一，腦出血后血管再生是其治療的關鍵所在，而VEGF是一種特異性作用于血管內皮細胞的多功能因子，其在急性腦出血恢復過程中發揮著重要作用[7]。生長相關蛋白-43(Growth associated protein,GAP-43)對神經的生長、發育、再生及突觸功能的維持和神經遞質的釋放過程中發揮著重要的作用，是神經再塑、再生的分子標志物[8]。本實驗主要是觀察以破血化瘀的中藥湯劑對急性腦內血腫大鼠的治療效果及其對VEGF和GAP-43表達的影響。

材料與方法

1 材 料

1.2 試 劑：人VEGF ELSIA試劑盒；Re-vertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒；GIBCOTM M199培養基干粉，引物;AEC顯色試劑盒；Ultra Sensitive TM S-P試劑盒; Boyden小室;鼠抗人VEGF、兔抗人VEG-FR2、AEC水性封片劑；recom-binant Taq酶(1U/μl)，dNTPs(10 mmol/L);3%戊巴比妥鈉，4%多聚甲醛溶液，明膠，10%水合氯醛。

1.3 設 備：顯微鏡(日本，Olympus公司); 顯微圖像分析Motic Images 2000 1.3、數碼成像系統; 凝膠成像系統及配套軟件 Quantity One(美國，BIO-RAD公司)；PE9600基因擴增儀(美國，PE公司);全自動酶標儀(美國，BioTek公司);電泳儀(美國，BIO-RAD公司)；電冰箱。其他使用器械:靜脈留置套管針、棉簽、棉球、醫用膠布、一次性醫用橡膠手套、止血鉗、彎鉤鉗、醫用手術縫合針、玻璃分針、持針器、眼科剪、器械盤、手術刀、手術縫合線等。

1.4 動 物：SD大鼠，6周齡，體重(150±20) g，雌雄各半，SPF級，由遼寧中醫藥大學基礎醫學院動物實驗中心提供。

2 方 法

2.1 動物模型的建立、分組及給藥：采用隨機數字表將大鼠，隨機分為破血化瘀湯組和空白對照組，每組20只。兩組以7 d連續灌胃給藥形式，一組以15 g/kg破血化瘀湯劑量，另一組則給予等量生理鹽水，2次/d，共14次，第8天注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈采血，靜置、離心、滅活處理之后，分離血清，收集上層血漿，低溫保存。

2.2 ELSIA檢測VEGF含量：依照人VEGF ELSIA試劑盒說明書，吸取各組經藥物處理48 h后的細胞培養上清液，進行檢測。

2.3 免疫組化及PCR檢測VEGF含量：將2 ml細胞懸液接種在置于10 cm2培養皿經預處理的蓋玻片，取出經48 h后藥物處理的蓋玻片，經過磷酸緩沖液(PBS)清洗，固定10 min的中性甲醛，經過透膜處理20 min以后，采用常規免疫組化對照檢測VEGF，選鼠抗人VEGF單克隆抗體為一抗，另一抗以PBS作陰性對照。應用Motic Images 2000 1.3采集圖像及顯微圖像對VEGF免疫組化圖片進行對照分析，蛋白的相對含量則采用平均灰度值來間接表示，與陽性反應產物成相反趨勢，蛋白含量越少，陽性反應產物越深，平均灰度值越小。分別對5 d、10 d、15 d的各組大鼠進行免疫組織染色，經10%水合氯醛(3.5 ml/kg體重)腹腔注射、麻醉，灌注破血化瘀湯劑，取腦組織。用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規石蠟制作石蠟切片染色，將明顯血腫切片選出，留用分析。對選出的切片進行室溫脫蠟，在3% H2O2溶液中靜置10 min，經過蒸餾水和磷酸緩沖液(PBS)沖洗6 min，再將切片浸于枸椽酸鹽緩沖液(PH6)中，每隔10 min后微波修復 5 min。自然冷卻至室溫后，滴加一抗(GAP-43)，于4℃冰箱孵育12 h。切片由磷酸緩沖液(PBS)沖洗6 min，甩干后滴加相應二抗，于恒溫箱(37℃)中孵育30 min，PBS再沖洗6 min。二氨基聯苯胺法(DAB)顯色5～10 min，注意控制染色深度，沖洗后，蘇木素復染1～2 min，再沖洗，脫水封片。隨機選取各時間點每組各標本于血腫區周圍6個視野，采用高倍鏡( ×400)進行觀察， 再利用Motic 3000數碼成像系統，計算平均每個視野內GAP-43的陽性細胞個數。每組GAP-43陽性蛋白細胞數以120個視野的平均值。

2.4 治療效果評價：分別將3種不同濃度的破血化瘀湯劑組與同血清含量的空白對照對比，觀察不同濃度的破血化瘀湯劑較同血清含量的空白對照組對VEGF水平的影響、對VEGF表達的影響、VEGF受體的影響；觀察造模后的第5天、第10天、第15天破血化瘀湯組與空白組相比對大鼠腦組織GAP-43蛋白表達的影響。

結 果

1 破血化瘀湯劑對VEGF水平的影響 分別將3種不同濃度的破血化瘀湯劑組與同血清含量的空白對照組對比，從VEGF ELISA 檢測結果(圖1)發現，2.5%含藥血清與2.5%空白對照組相比能顯著提高血管內皮生長因子VEGF的含量(P<0.05)，說明該濃度的含藥血清能夠顯著促進VEGF的分泌;而其余濃度的含藥血清對VEGF的作用不是十分顯著。

2 破血化瘀湯劑對VEGF表達的影響 Motic 3000處理免疫組化照片的圖像分析結果(圖1)顯示，與同血清含量的空白對照相比，2.5%含藥血清組的VEGF灰度值最小，表明該組細胞內VEGF相對含量最高，同時也能顯著促進VEGF的合成(P<0.05)，另外兩種藥物濃度對VEGF的含量水平與合成均無顯著影響。

3 破血化瘀湯劑對VEGF受體的影響 RT-PCR的檢測結果(表2，圖1)顯示，分別將3種不同濃度的破血化瘀湯劑組與同血清含量的空白對照相比，2.5%含藥血清與2.5%的空白對照組相比，血管內皮生長因子VEGF含量、及其受體的轉錄水平(P<0.05)二者都顯著提高;而較高濃度5%含藥血清與5%的空白對照組相比，5%含藥血清對VEGF本身的轉錄有影響;而對VEGF及其受體的表達均無顯著影響是較低濃度1.25%含藥血清。

表1 破血化瘀湯對VEGF表達的影響

注：A-C依次為1.25%，2.5%，5%破血化瘀湯劑血清；D-F依次為1.25%，2.5%，5%空白血清

圖1 RT-PCR 檢測 VEGF mRNA 表達結果

4 破血化瘀湯劑對大鼠腦組織GAP-43蛋白表達的影響 高倍鏡下大鼠腦組織GAP-43陽性細胞，顏色呈淡黃色或棕黃色，主要表達于血腫區神經元胞質中，膠質細胞僅有少量表達。造模后的第5天，各破血化瘀GAP-43均有表達，隨時間增加表達也隨之增加，在第10天后，開始有不同程度下降。與空白組相比，破血化瘀湯組第10天、15 天的GAP—43陽性細胞數顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各時間點各組大鼠腦組織GAP-43陽性細胞數比較

討 論

急性腦內血腫是指由于外傷導致顱內出血，隨著出血加重，血腫迅速形成，并在72 h內造成顱內壓升高或者腦疝形成[9-10]。腦內血腫常發生的部位大致在硬膜外、硬膜下及腦內三類，不同的損傷部位，患者的病情程度也不同。硬膜外血腫受損程度較輕，患者在昏迷之間伴隨清醒；硬膜下血腫相對之下，昏迷發生快、昏迷時間持續長、顱內壓突發升高，不易控制；腦內血腫患者的腦實質受損較為嚴重，由輕度昏迷轉變深度昏迷，支配重要功能的部位易被血腫壓迫，預后較差[11-14]。若臨床恢復期除了采取一般的西醫治療以外，配合使用適宜的中藥湯劑，對癥治療，能夠盡快幫助患者預后恢復，早日返回日常生活當中。

本實驗中VEGF ELISA 檢測結果發現，2.5%含藥血清與2.5%空白對照組相比能顯著提高血管內皮生長因子VEGF的含量，說明該濃度的含藥血清能夠顯著促進VEGF的分泌;而1.25%和5%的含藥血清對VEGF的作用不是十分顯著。而圖像分析結果顯示，與同血清含量的空白對照相比，2.5%含藥血清組細胞內VEGF相對含量最高，能顯著促進VEGF的合成，而另外兩種藥物濃度對VEGF的含量與合成均無顯著影響。RT-PCR的檢測結果顯示2.5%含藥血清與2.5%的空白對照組相比，血管內皮生長因子VEGF含量、及其受體的轉錄水平都顯著提高;而較高濃度5%含藥血清與5%的空白對照組相比，5%含藥血清對VEGF本身的轉錄有影響，而對VEGF及其受體的表達均無顯著影響是較低濃度1.25%含藥血清。表明破血化瘀湯劑可以促進腦內血管內皮的生長因子VEGF，不同藥物濃度對 VEGF的影響也不同，灌胃給藥10 d后的正常大鼠，血清中VEGF含量明顯升高，同時，僅2.5%濃度含藥血清能顯著促進VEGF的合成。

正常生理狀態下，生長相關蛋白-43(Growth associated protein,GAP-43)處于低水平，而當腦神經損傷時, GAP-43表達的增高是內源性神經再生的顯著特征[15]。因此, GAP-43可以用來標記神經元發育生長、神經再生以及成熟中樞神經系統中突觸重建。故GAP-43高表達是在腦組織因缺血、缺氧，激活神經纖維發芽、突觸重建的神經再生的過程[16]。實驗中，GAP-43在腦血腫后第5天就開始表達，至第10天逐漸降低，表明破血化瘀湯劑可以有效提高腦血腫大鼠腦組織GAP-43陽性表達，并延緩其下降，從而促進腦缺血后神經的再生，增加中樞神經系統的修復能力。

總之，破血化瘀湯劑有助于促進急性腦內血腫血管內皮VEGF的生長以及利于大腦神經元神經GAP-43再生。