花椰菜小孢子胚狀體增殖及植株再生

文正華 劉莉莉 張小麗 江漢民 姚星偉 牛國保 單曉政 周志杰

摘 要： 為建立穩定的胚狀體增殖成苗技術體系，以期穩定獲得足夠的再生植株，以花椰菜小孢子胚狀體為試材，研究了植物生長激素6-BA、NAA對胚狀體增殖及再生苗生根培養的影響。結果表明，胚狀體在附加1.25 mg·L-1 6-BA+0.025 mg·L-1 NAA的改良MS培養基上培養，增殖系數最高，可達10.3；再生苗在附加濃度為1.0 mg·L-1NAA生根培養基上的生根效果最佳，平均每芽上生根數達到8.1個。因此，6-BA和NAA配合使用，可顯著提高胚狀體增殖系數；生根培養基中，添加適量的NAA可增加再生苗的生根數。

關鍵詞： 花椰菜； 胚狀體； 增殖； 植株再生

Abstract： To establish a stable system of embryoid proliferation for obtaining enough regenerative plants， the effects of plant hormone 6-BA and NAA on the embryoid proliferation and regenerative seedling rooting were studied in this study， the microspore embryoid of cauliflower was used as the test materials. The results showed that the embryoids exhibited the highest proliferation coefficient， up to 10.3， when cultured in an improved MS medium with an additional 1.25 mg·L-1 6-BA +0.025 mg·L-1 NAA. The regenerative seedlings rooted best in medium with the added concentration of 1.0 mg·L-1 NAA， and the average number of roots per bud reached 8.1. Therefore， the combination utilization of 6-BA and NAA could significantly increase the reproduce of embryoid， medium adding moderate NAA could increase root number of regenerated seedlings.

Key words： Cauliflower； Embryoid； Proliferation； Plant regeneration

花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis）又名菜花、花菜，椰菜花、芥藍花、花甘藍、球花甘藍；清代稱為番芥藍，是十字花科蕓薹屬甘藍類的蔬菜。花椰菜食用器官為花球，其營養豐富、風味鮮美、外形美觀，深受廣大消費者的喜愛，在農業生產中占有一定地位，世界各地均有種植，我國各地已普遍栽培。目前我國已成為世界上花椰菜第一生產大國，花椰菜在蔬菜周年供應中占有越來越重要的地位。

目前市場上推廣的花椰菜品種絕大多數是F1，采用常規方法從分離純化親本，再到測配組合一般需6～8 a（年），育種時間較長。而游離小孢子培養技術可以快速獲得純合體，縮短育種年限，既提高育種效率，同時由小孢子培養獲得的胚狀體和再生苗還可以廣泛應用于遺傳圖譜構建、基因定位、轉基因育種以及染色體工程等。隨著現代生物技術的飛速發展，人們采用基因轉化技術使其獲得新型重要的園藝性狀成為了可能[1-6]，而基因轉化工作的前提就是建立高效的離體再生體系，小孢子胚狀體增殖成苗的數量和質量成為此技術應用上最重要的環節，筆者旨在建立穩定的胚狀體增殖成苗技術體系，以期穩定獲得足夠的再生植株，對花椰菜的遺傳育種和轉基因應用研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為天津科潤蔬菜研究所實驗室花椰菜雙單倍體材料D1小孢子游離后再分化生長發育形成的胚狀體。試驗于2017年4—11月在天津科潤蔬菜研究所實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 不同激素濃度配比對胚狀體增殖的影響 胚狀體接種于不同激素濃度配比的改良MS培養基（NH4NO3減半+0.4%瓊脂+3%蔗糖）中，培養基pH在高壓滅菌前調為5.8左右，培養溫度為25 ℃左右，光照強度為1 600～2 000 lx，每天光照時數為14 h。100 mL三角瓶中分裝25 mL培養基，每瓶接種5個外植體，在組培架上隨機區組排列。以不含激素的改良MS為對照（CK），培養25 d后觀察結果并記錄成苗數量和品質，進行統計分析。

1.2.2 叢生芽生根培養 將叢生芽切分成獨立的小苗接種在不同生長素（NAA）的MS培養基（0.4%瓊脂+3%蔗糖）中，培養誘導生根，并形成完整的再生植株，100 mL三角瓶中分裝25 mL培養基，每瓶接種5個外植體，在組培架上隨機區組排列。以不含激素的MS培養基為對照（CK），培養15 d后觀察結果并記錄生根情況，進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對胚狀體增殖的影響

由表1可知，在不加激素的情況下，胚狀體繼續正常發育生長，但沒有再生芽誘導發生。6-BA和NAA共同使用可顯著提高胚狀體增殖系數，1.25 mg·L-1 6-BA+0.025 mg·L-1 NAA處理為本試驗中的最佳激素配比，此時胚狀體增殖系數最高，可達10.3，叢生芽的數量多且品質好（圖1）。當6-BA濃度一定時，隨著NAA濃度的增加，胚狀體愈傷組織化程度增高，再生根數目增多，NAA的適宜質量濃度為0.025 mg·L-1；當NAA質量濃度一定時，隨6-BA質量濃度的增加，根的再生受到抑制，當6-BA質量濃度超過1.25 mg·L-1時，芽再生頻率下降，且玻璃化加深，成苗數量和品質下降。

2.2 叢生芽分離誘導生根

從表2看出，添加生長激素對生根率無影響，但對生根數有明顯促進效果，當NAA質量濃度為1.0 mg·L-1時，生根效果最佳，根數最多且正常，平均每芽上生根數達到8.1個（圖2），激素質量濃度提高后，根系加粗變短，不利于后續的移栽成活。

3 討論與結論

植物材料的不同品種、不同取材時間、培養基中激素組成及質量濃度、不同取材部位等均能影響外植體的芽分化頻率[7-8]，其中確定適宜的外植體類型（即供體細胞及生理狀態）與培養基成分及其濃度最為關鍵，直接決定著器官分化的模式和程度[9]。筆者主要探討植物激素中的6-BA與NAA的質量濃度配比對胚狀體芽增殖培養的高效再生影響。一般認為細胞分裂素如6-BA，是有利于芽的分化，而生長素如NAA是有利于根的分化和愈傷組織的形成，細胞分裂素與生長素的比值高有利于芽的分化[10]。添加植物生長激素對生根率并無影響，但對生根數有較明顯促進效果，激素超過適宜濃度后，再生苗根系加粗變短，不利于移栽成活。

試驗的最終目的是穩定獲得正常植株，但在誘導生根的過程中，再生苗玻璃化現象比較嚴重。造成玻璃化苗的原因有很多，如培養基的水分含量過高、外植體中乙烯含量過高等[11]。由試驗結果可知，過高的6-BA濃度是導致再生苗玻璃化的原因之一。通常降低玻璃化頻率的方法是提高培養基的滲透壓如加入活性炭，以及降低激素的使用濃度。植物細胞在離體培養過程中會產生大量乙烯，尤其是在密閉的培養容器中，乙烯的大量累積會直接影響外植體生長和芽分化。AgNO3對許多植物的形態發生有促進作用[12-13]。一般認為，Ag+作為一種乙烯抑制劑并非抑制乙烯的合成，而是通過促進多胺的合成來提高體細胞胚胎和芽的發生頻率[14]。據報道，在用外植體誘導不定芽的培養基中添加適量AgNO3，可顯著提高蕓薹屬植物離體培養條件下芽的再生頻率[15-16]。

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