穩定表達人巨噬細胞集落刺激因子的L929細胞株的建立*

陸 琤 周晨辰 張鵬飛 張 硌 張 鵬*

L929細胞是小鼠表皮成纖維細胞，L929細胞培養上清中含有較高濃度的巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)[1]。M-CSF是一種由成纖維細胞或上皮細胞等產生的細胞因子，能調節巨噬細胞的生存、增值和分化。使用含L929上清的條件培養基與重組M-CSF誘導分化獲得的骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)在形態、純度、殺菌能力和吞噬細菌能力等方面無顯著差異[2]。因此，含L929上清的條件培養基可用來代替昂貴的重組M-CSF誘導分化骨髓巨噬細胞。但該條件培養基僅限用于誘導分化鼠的巨噬細胞，并不能用于人的巨噬細胞的培養。基于此，本研究通過慢病毒重組系統將人M-CSF基因重組入L929的基因組中，使其能高效表達人巨噬細胞集落刺激因子(human macrophage colonystimulating factor，hMCSF)，為體外培養人源的巨噬細胞提供廉價又方便的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

包裝質粒pMD、SPA為本實驗室保存，載體質粒pCDH-X、pCDH-hMCSF-HA由北京梓熙生物科技有限公司合成。293TX細胞和L929細胞為本實驗室保存。脂質體轉染試劑(Lipofectamine2000)購自美國Invitrogen Life Technologies公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；血清購自美國Hyclone；0.22 μm濾器購自美國PALL公司；超濾離心管購自美國millipore公司。增強化學發光(enhanced chemi luminescence，ECL)顯影試劑購于美國Thermo公司，其余常用試劑均為國產分析純。

1.2 載體質粒pCDH-hMCSF-HA的構建

從國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網站上找到hMCSF序列后連接血凝素抗原(hemagglutinin antigen，HA)標簽蛋白便于蛋白質印跡(western blot，WB)檢測。將該目的基因片段插入載體pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro的EcoR1/BamH1兩個酶切位點之間，該載體質粒pCDH-hMCSF-HA交由北京梓熙生物科技有限公司合成。

1.3 慢病毒包裝

293TX細胞于對數生長期時接種于60 mm直徑的培養皿中，用含10%胎牛血清的高糖培養基(dulbecco"s modified eagle medium，DMEM)培養。將1μg pMD、3μg SPA、4μgpCDH-X/pCDH-hMCSF與100 μl無血清1640培養基溫和混勻，Lipofectamine 2000 16 μl與100 μl無血清1640培養基溫和混勻，室溫靜置5 min，再將二者混勻，室溫靜置20 min，將混合液緩慢滴入293TX細胞中，即完成包病毒過程。轉染后8 h或過夜后換液，24～36 h收一次上清，補液5 ml。約72 h后再收上清，3000 r/min離心5 min，使得細胞等雜質沉淀，取上清用0.22 μm濾器過濾后加入超濾離心管，5000 r/min，離心20 min后得約200 μl濃縮病毒，置于-40 ℃保存或立刻使用。

1.4 L929細胞培養及感染

取適量L929細胞接種于60 mm直徑的培養皿內，加入含20%胎牛血清的DMEM，于37 ℃、5%CO2培養。當細胞長至對數增長期時，取少量接種至12孔板中的一孔，加入濃縮病毒約20 μl，感染后72 h，在倒置熒光顯微鏡下，激發光(450～490 nm藍光波長)照射下，觀察L929感染情況。加入嘌呤霉素篩選感染成功的細胞，終濃度為20 ng/ml。第2 d更換培養液，未感染成功的細胞已被殺死，感染成功的細胞完好，待感染成功的細胞長滿后，將其接種入新的60 mm直徑的培養皿中進行擴大培養。

1.5 WB方法檢測hMCSF表達

取適量過表達pCDH-X、pCDH-hMCSF-HA的L929細胞，并收集其上清，制成上樣液，用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)凝膠分離；90 mA，3 h電轉至硝酸纖維素膜；用5%脫脂奶，水平脫色搖床室溫震蕩封閉1 h；與1∶1000稀釋后的HA一抗4 ℃孵育過夜；三羥甲基氨基甲烷鹽吐溫(tris buffered saline tween，TBST)緩沖液漂洗3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG二抗，水平脫色搖床室溫孵育1 h；TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min；用增強化學發光(enhanced chemi luminescence，ECL)試劑盒顯影并觀察結果。

2 結果

2.1 慢病毒感染L929細胞結果

(1)用于包病毒的載體pCDH-X/pCDH-hMCSFHA能夠表達綠色熒光蛋白，因此未被慢病毒感染的L929在熒光顯微鏡下不發光(如圖1所示)。

(2)被病毒pCDH-X感染過的L929在熒光顯微鏡下發綠色熒光，表明病毒感染成功(如圖2所示)。

圖1 未處理的L929細胞熒光顯微鏡圖(×40)

圖2 過表達pCDHX的L929細胞熒光顯微鏡圖(×40)

(3)被病毒pCDH-hMCSF-HA感染過的L929在熒光顯微鏡下發綠色熒光，表明病毒感染成功(如圖3所示)。

圖3 過表達pCDH-hMCSF-HA的L929細胞熒光顯微鏡圖(×40)

2.2 WB檢測結果

WB結果顯示，過表達pCDHX的L929細胞培養上清(L929pCDH-X SUP)和細胞裂解液(L929pCDH-X CELL)檢測不到特異性條帶，而在過表達pCDH-hMCSF-HA的L929細胞的培養上清(L929pCDH-hMCSF-HA SUP)和細胞裂解液(L929PCDH-hMCSFHA CELL)中檢測到特異性條帶，且L929PCDH-hMCSF-HA SUP中檢測到的特異性條帶比L929pCDH-hMCSF-HA CELL稍大，是因為M-CSF是一種由鏈間二硫鍵連接而成的同源二聚體糖蛋白，由于其糖基化和蛋白水解等翻譯后修飾會產生不同的可溶性形式，分子量為40～90 kDa[3-8]。本研究結果檢測到的特異性條帶大小符合上述范圍(如圖4所示)。

圖4 western blot檢測上清及細胞中hMCSF的表達示圖

3 結論

本研究在設計載體質粒pCDH-hMCSF時，在目的基因hMCSF后連入HA標簽蛋白。HA標簽蛋白，源于流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇，為9個氨基酸，對外源靶蛋白的空間結構影響小，易于用Anti-HA抗體檢測。

本研究采用嘌呤霉素作為抗性篩選劑，是由于pCDH載體上含有嘌呤霉素抗性基因，因此加入終濃度為20 ng/ml的嘌呤霉素可篩除未感染成功的細胞。加入嘌呤霉素后存活的細胞生長較好，與野生型的L929細胞相比，在形態上及生長速度上無明顯差異。

hMCSF具有能夠刺激巨噬細胞生長和分裂的功能，臨床及科研中均具有重要的應用價值和前景。天然來源的M-CSF含量低，且分離純化不易，因而價格昂貴[9-10]。體外培養巨噬細胞的傳統方法主張每2～3 d補加細胞因子，以保證足夠的細胞因子濃度，但這種方法花費巨大。而L929細胞增殖速度快，耐受力強，容易培育，通過慢病毒感染的L929細胞能高效表達人源M-CSF，可替代價格昂貴的細胞因子，其方法的培養來源于人體的巨噬細胞，比來源于鼠的巨噬細胞更接近人體機能，可作為體外研究的材料而進一步為研究巨噬細胞生物學作用創造條件。