粘彈性參數與大鼠脂肪肝程度的相關性研究*

蘇 晨 李國洋 劉 冬 錢林學* 曹艷平

隨著居民生活水平提高，肥胖患者日益增多，而非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發病率也在逐年升高[1]。NAFLD是一種由于脂滴在肝細胞內堆積進而形成疾病，根據肝臟中是否出現炎癥細胞，可以分為單純性脂肪變性(simple steatosis，SS)和脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)[2-3]；其中SS若不及時診斷和治療，則會進展為NASH，后者10年內肝硬化發生率高達25%[4-7]。因此，早期診斷NAFLD尤為重要。

超聲檢查是初步篩選NAFLD的首選方法，其價格低廉，無放射損傷，但對輕度脂肪肝不敏感，且難以鑒別肝纖維化[8-9]。目前，超聲彈性成像已被初步證實在評估慢性肝炎及肝纖維化程度上具有重要價值[10]。現有的超聲彈性成像技術都是基于假設肝臟是純彈性體的理論而發展的方法[11-12]。然而，所有生物組織都具有粘彈性，所以利用現有的超聲彈性成像技術來早期診斷SS并不理想[13-14]。壓痕松弛實驗是一種用于表征固體粘彈性的可靠方法，因此，本研究旨在應用壓痕松弛實驗得到相關粘彈性參數，探究其與非酒精性肝臟脂肪變性程度的相關性，從而為其將來用于早期診斷SS奠定基礎[15]。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取健康清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠40只，體重為(200±20)g，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養環境為無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級，由首都醫科大學北京友誼醫院動物實驗中心飼養。40只SD大鼠在取得病理結果之前，根據造模方法，將其隨機分為對照組(10只)和實驗組(30只)；實驗中對照組和實驗組各死亡3只；根據最終病理結果將剩余的34只SD大鼠重新分為正常(S0)組(7只)、輕度肝臟脂肪變性(S1)組(7只)、中度肝臟脂肪變性(S2)組(10只)和重度肝臟脂肪變性(S3)組(10只)，共4組。

1.2 儀器與飼料

采用ElectroForce?3100型壓痕實驗儀(美國Bose公司)。高脂飼料選用MD12033 60%高脂飼料(江蘇美迪森公司)。

1.3 非酒精性脂肪變性肝臟模型建立

清潔級雄性SD大鼠40只，在取得病理結果之前，將其隨機分為2組，即對照組(10只)和實驗組(30只)，一周適應性喂養之后，對照組10只大鼠繼續進行基礎喂養，實驗組30只大鼠更換高脂飼料(60%高脂飼料，MD12033，平均每只20 g/d)喂養，之后每隔2周依次處理實驗組10只及對照組3～4只。

1.4 實驗前準備

將所有進行實驗的SD大鼠仰臥位固定在實驗臺上，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)進行腹腔麻醉，在劍突水平做腹橫切口(1.5～2.0 cm)，充分暴露肝臟后，將肝動脈和肝門靜脈與下腔靜脈均進行結扎，結扎過程結束后，將肝臟分離。

1.5 實驗原理與方法

粘彈性普遍存在于生物組織中，在外界應力作用下會出現形變滯后現象，當總應變保持不變時，組織內部的變形恢復力(回彈應力)會隨時間逐漸降低[16]。

壓痕實驗是一種用于表征固體粘彈性的可靠方法，在表征生物材料力學特性方面具有特殊的優勢[15，17-18]。此實驗應用既往研究中已形成的理論，通過球形壓頭和離體肝臟組織接觸并加壓使其產生形變后(實驗壓頭直徑3.5 mm，肝臟模型被壓下約1 μm)，保持壓頭不動，由下方壓力傳感器測量壓力變化，獲得載荷—位移曲線，從而得到可用于描述組織粘彈性特性的相關參數，即松弛時間(s)(t1，t2)，表示其在形變一定的情況下，組織內部應力降低的時間，t1為應力下降開始時間，t2為應力降低到平衡時的時間[15，19]；應力松弛程度(g1，g2)，表示組織內部應力降低的程度，g1為下降開始時的變化程度，g2為降低到平衡時的變化程度。實驗儀器以及粘彈性參數獲取過程如圖1所示。

圖1 壓痕實驗示意圖

1.6 肝臟粘彈性測定

在壓痕實驗過程中，本研究選擇SD大鼠離體肝臟中2個較大的肝葉，即肝左外側葉(left lateral lobe，LLL)和肝中葉(median lobe，ML)，并對每個肝葉各進行2次獨立測試，在每個SD大鼠離體肝臟各獲得4組實驗數據，取其平均值作為該肝臟的最終結果。實驗過程中的環境溫度和濕度分別約為25 ℃和50%，實驗用肝臟以及選取實驗點位置如圖2所示。

1.7 肝臟病理檢測

將實驗點處的肝臟組織剪下，固定于10%的福爾馬林液體中，于24 h更換福爾馬林液，72 h取出，常規石蠟包埋，連續切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色。肝臟脂肪變性程度參照脂肪肝病理診斷Brunt分級標準[20]。

表1 壓痕實驗結果

表1 壓痕實驗結果

注：表中t1為應力下降開始時間(秒)，t2為應力降低到平衡時的時間(秒)；應力松弛程度(g1，g2)表示組織內部應力降低的程度，g1為下降開始時的變化程度，g2為降低到平衡時的變化程度。

參數 S0組(7只) S1組(7只) S2組(10只) S3組(10只)g1 0.453±0.034 0.483±0.023 0.482±0.023 0.453±0.027 g2 0.228±0.008 0.215±0.007 0.240±0.026 0.235±0.014 t1(s) 0.520±0.090 0.481±0.043 0.551±0.103 0.599±0.068 t2(s) 24.410±2.302 24.781±1.926 28.666±2.120 31.577±2.110

圖2 大鼠肝臟圖及實驗點選取示意圖

1.8 統計學方法

應用Excel表格建立數據庫，采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析，粘彈性參數與大鼠脂肪肝程度的相關性采用Pearson相關性分析，以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理結果

動物模型共40只，獲得病理結果前，對照組和實驗組各死亡3只。將SD大鼠肝臟進行病理分析后，根據脂肪肝病理診斷Brunt分級標準，將剩余36只SD大鼠重新分組，最終得到S0組7只，S1組7只，S2組10只，S3組10只，如如圖3所示。

圖3 SD大鼠最終分組數量及不同程度脂肪變性肝臟的病理切片圖(×40)

2.2 SD大鼠肝臟粘彈性參數一般情況

SD大鼠肝臟的粘彈性參數都通過壓痕實驗獲得，4個粘彈性參數分別以“平均值±標準差”表示。SD大鼠肝臟的松弛程度(g1)測值范圍為0.426～0.506；松弛程度(g2)測值范圍為0.208～0.266；松弛時間(t1)測值范圍為0.438～0.667；松弛時間(t2)測值范圍為22.108～33.687(見表1)。

2.3 粘彈性參數與大鼠脂肪肝程度相關性

Pearson相關分析顯示，SD大鼠肝臟脂肪變性程度與松弛時間(t1，t2)呈正相關，差異有統計學意義(r=0.405，r=0.802；p＜0.05)；其中，與松弛時間(t2)相關性更好；肝臟脂肪變性程度與應力松弛程度(g1，g2)均不相關，見表2。

表2 Pearson相關分析結果

3 討論

NAFLD的早期診斷對臨床工作有著重要意義，該病變基礎是脂滴在肝細胞內堆積進而造成肝臟代謝和功能異常[7，20-21]。近年來，超聲彈性成像被廣泛應用于肝臟疾病的診斷，對其在脂肪性肝病中的應用也有報道[22-26]。在過去的20年中，已經形成了數種超聲彈性成像方法。其中剪切波彈性成像(shear wave elastography，SWE)使用最為廣泛，因其能夠定量地表征肝組織的彈性特征[27]。在該方法假設組織是純彈性體，通過測量剪切波速(shear wave velocity，SWV)，應用公式：E=3ρSWV2(其中ρ表示組織密度)來計算組織彈性模量(用E表示)[11-12]。然而，所有生物組織都具有粘彈性，單純測量其彈性特征有一定的局限性[13-14]。

以往為了彌補此方法的缺陷，研究者們對NAFLD發展過程中肝臟的粘彈性變化進行了不斷探索。Barry等[13]對70只小鼠的肝臟進行了離體實驗，并得出利用爬行波的頻散可以反映組織粘彈性，并用于區分肝臟脂肪變性的程度。此外，一項研究用動態力學分析(dynamic mechanical analysis，DMA)方法來評估體外大鼠模型的肝組織粘彈性，也證明肝組織粘彈性與脂肪變性程度相關[28]。然而，Nightingale等[29]利用剪切波頻散原理，對135名NAFLD患者進行了肝臟粘彈性測定，研究結果顯示，未觀察到粘彈性參數與不同的脂肪變性階段之間的相關性。

本研究表明，出現這種結果不統一的主要原因是由于DMA中使用的正弦負載的頻率通?！?0 Hz，而剪切波的頻率通常在數百赫茲的數量級?；诖?，結合DMA和剪切波頻散分析都顯示出評估肝臟脂肪變性階段的粘彈性特征的局限性，本研究旨在探究脂肪肝粘彈性在壓痕實驗的時間尺度(秒級)是否有相關性[15，30]。經過實驗證實以及統計學分析，本研究結果顯示，肝臟脂肪變性程度與松弛時間(t1，t2)呈正相關，其中，與反映組織內部應力降低到平衡時的時間(t2)相關性更好。

本研究尚有不足之處：①通過壓痕松弛實驗來獲得離體肝臟的粘彈性參數，這種有創診斷方法仍處于研究階段，不適于在此階段直接應用于臨床。然而近期有學者提出了基于超聲的松弛和(或)蠕變實驗[28-31]借助于該方法，未來可以將壓痕實驗應用于臨床；②NAFLD包括一系列臨床和組織病理學變化，包括單純性脂肪變性，伴有炎癥的脂肪變性，脂肪性肝炎，肝硬化和肝細胞癌[32]。本研究中，SD大鼠肝臟脂肪變性模型未出現明顯的炎癥和纖維化，因此，炎癥和纖維化如何影響肝組織的粘彈性仍需進一步研究。

4 結語

在本研究中，應用壓痕實驗來評估NAFLD大鼠模型中肝組織的粘彈性，其結果表明，隨著肝臟脂肪變性程度的增加，粘彈性參數松弛時間(t1，t2)與非酒精性肝臟脂肪變性程度顯著相關。此發現為脂滴在肝臟中堆積進而影響肝臟機械特性的現象提供了新的信息，并可能有助于早期診斷NAFLD。