固相萃取-氣相色譜法測定茶葉中氟環唑

李崢嶸，黃曉東

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

氟環唑(epoxiconazole)，分子式C17H13ClFN3O，是德國巴斯夫公司研發的內吸型、長效、低毒三唑類含氟殺菌劑，在預防和防治一系列禾谷類作物病害方面取得了良好效果[1-2]． 近年來隨著三唑類殺菌劑的使用和亂用，對生態環境造成極大危害[3-4]．2015年，氟環唑被歐盟劃分為“(1類、2類)生殖毒性”和“(2類)致癌”的農藥[5]．歐盟規定了氟環唑在茶葉上的MRLS(最大殘留量)值為0.05 mg/kg．目前我國在此方面無明確規定，可能會導致我國茶葉出口在歐盟受阻，故研究氟環唑殘留量檢測方法具有現實經濟意義．

目前對氟環唑殘留量的檢測大多數集中在蔬菜和谷物中，檢測方法有UPLC-MS/MS[6-9]，GC-MS/MS[10-11]等．茶葉中的氟環唑殘留分析凈化多用中性氧化鋁[12]、GCB柱(石墨化炭黑)[13]、TPT混合填料柱[14-15]、GPC(凝膠滲透色譜)[16]以及QuEChERs(分散固相萃取)[17]等凈化方法，以上方法均可靠，但步驟較為繁瑣．實驗采用Florlisil柱-氣相色譜法檢測茶葉中氟環唑殘留量，簡化了前處理步驟，提高了實驗精確性和穩定性，是有效監督控制氟環唑殘留量的檢測方法．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶，產自蕪湖；乙腈、丙酮、正己烷、甲醇、氯化鈉(色譜純或分析純)；C18萃取柱；NH2萃取柱；Florlisil柱；氟環唑標樣(濃度≥99%，德國Dr.Ehrenstorfer)；超純水．

1.2 儀器與設備

GC-2010氣相色譜儀(配有ECD)(日本島津公司)；VX-200渦旋混合器(美國Labnet)；旋轉蒸發濃縮儀(上海弘懿儀器設備有限公司)；TGL-16G離心機(上海安亭儀器廠)．

1.3 實驗方法

(1)氣相色譜條件.色譜柱：DB-17柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；溫度：INJ為250 ℃ ；DET為300 ℃；COL為180 ℃(1 min)，8 ℃/min ，250 ℃(10 min)；載氣 ：高純氮氣 ，柱流量 2.0 mL/min；進樣方式：不分流，進樣量1 μL．

(2)標準曲線的繪制.準確稱取10 mg氟環唑標準品，用正己烷溶解配制成1.0 mg/mL的氟環唑標準儲備母液(不用時置于-18 ℃以下冰箱避光儲存)和0.01 mg/mL的氟環唑儲備液(不用時置于0 ℃～4 ℃冰箱避光儲存)．用正己烷稀釋成1.0 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.06 μg/mL、0.02 μg/mL的氟環唑標準溶液，在選定色譜條件下進行GC-ECD檢測，并計算氟環唑標準曲線線性關系方程．

(3)樣品前處理．用粉碎機將茶葉粉碎成末，過100目篩．稱取1.0 g茶葉粉樣品于50 mL加蓋離心管中，加入18 mL乙腈和0.4 g NaCl，渦旋混勻，超聲輔助提取12 min，8 000 r/min離心10 min，轉移上清液至雞心瓶中，真空旋轉濃縮近干，加入5 mL正己烷-丙酮(7+3)超聲溶解，上樣至Florlisil柱+GCB混合柱，接出流出液，再每次用2 mL正己烷-丙酮(7+3)3次清洗雞心瓶，并將洗滌液加入柱中，繼續加入20 mL正己烷-丙酮(7+3)洗脫，旋轉濃縮近干，其后加入1 mL甲醇-水(9+1)超聲溶解，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜轉移至進樣瓶，供GC-ECD分析．

(4)固相萃取條件選擇．

①提取劑的選擇．準確稱取4組相等的茶葉樣品，同時添加質量濃度為0.05 mg/kg的氟環唑標準液，分別用正己烷、乙腈、丙酮和甲醇作為提取劑，在其他實驗條件保持不變的情況下，按照上述步驟進行樣品前處理，供GC-ECD分析，計算回收率，確定提取劑的種類．

②提取劑體積的選擇．準確稱取5組相等的茶葉樣品，同時添加質量濃度為0.05 mg/kg的氟環唑標準液，只改變提取劑的體積，分別用10 mL、15 mL、20 mL、25 mL和30 mL選定的提取劑提取，計算回收率，確定提取劑的體積．

③NaCl加入量的選擇．準確稱取5組相等的茶葉樣品，同時添加質量濃度為0.05 mg/kg的氟環唑標準液，只改變NaCl固體加入量，NaCl加入量分別為0.0 g、0.4 g、0.8 g、1.2 g、1.6 g，計算回收率，確定NaCl加入量．

④超聲處理時間的選擇．為了使凈化效果達到最佳，實驗采用超聲輔助的方法，超聲時間分別設定為0 min、5 min、10 min、15 min和20 min，其他條件不變，計算回收率，確定超聲處理時間．

⑤洗脫液比例的優化．準確稱取4組相等的茶葉樣品，同時添加質量濃度為0.05 mg/kg的氟環唑標準液，只改變洗脫液正己烷、丙酮的體積比，體積比分別為6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，計算回收率，確定洗脫液比例．

⑥固相萃取柱選擇.為了使凈化效果達到最佳，分別選用C18，NH2和Florlisil 3種固相萃取柱，氟環唑標準液質量濃度為0.05 mg/kg，其他條件不變，計算回收率，確定最佳萃取柱．

⑦方法的重復性實驗．在選定的最佳實驗條件下對加標水平為0.05 mg/kg的茶葉樣品進行處理及測定，連續5天每天測一次，計算其精密度．

⑧方法的回收率實驗．取3份等量的茶葉樣品，選擇3種不同質量濃度的氟環唑標準液進行加標，添加水平分別為0.02 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg，采用最佳的實驗條件進行分析，連續測定5次，取平均值，計算回收率和變異系數．

⑨結果計算公式．氟環唑質量含量c1(ug/g)按下式計算

式中，c1為樣品中氟環唑含量(μg/g)；c為儀器檢測的質量濃度(mg/L)；V為最終定容體積(mL)；m為樣品質量(g)．

2 結果與討論

2.1 提取劑的選擇

氟環唑在不同提取劑中的溶解度是不一樣的，在滿足實驗要求的前提下，不同的提取劑對氟環唑的回收率有一定的影響．提取劑對氟環唑回收率的影響如圖1所示.由圖1可知，乙腈和丙酮作為提取劑，回收率較高，實驗過程中發現丙酮萃取液中含有大量的色素，導致后續的凈化過程存在一定的困難，故選擇乙腈作為提取劑．

2.2 提取劑體積的選擇

選定乙腈作為提取劑，改變乙腈的體積，考察乙腈體積對氟環唑回收率的影響， 結果如圖2所示.由圖2可知，乙腈體積為20 mL時回收率最高；乙腈體積小于20 mL時，提取的不夠充分；乙腈體積大于20 mL時，導致后續濃縮過程的氟環唑的損失，故選擇最優提取劑體積20 mL．

圖1 提取劑對氟環唑回收率的影響 圖2 提取劑體積對氟環唑回收率的影響

2.3 NaCl加入量的選擇

在樣品溶液中加入NaCl會降低待測物在水相中的溶解度、制約萃取劑在水中的溶解性，從而有利于對待測組分回收．NaCl質量對氟環唑回收率的影響如圖3所示.由圖3可知，在NaCl的用量逐漸增加時氟環唑的回收率先增加后降低，在NaCl的用量為0～0.8 g時，回收率呈線性增加，NaCl加到0.8 g時成為轉折點，隨著NaCl質量濃度增高導致萃取效果變差，回收率降低．因此選擇0.8 g作為NaCl的最佳用量．

2.4 超聲處理時間的選擇

樣品的前處理過程中，超聲輔助萃取可以提高萃取效率．實驗具體考察了不同的超聲處理時間對氟環唑回收率的影響，結果如圖4所示.由圖4可知，超聲處理時間由0 min到15 min時，萃取效果在提高，繼續超聲處理，其促進作用達到了飽和，可能是因為氟環唑見光易分解的特性，長時間暴露在日光中，有部分損失掉了，使得氟環唑的回收率開始下降，綜合考慮超聲時間為15 min時最佳．

圖3 NaCl質量對氟環唑回收率的影響 圖4 超聲時間對氟環唑回收率的影響

2.5 洗脫液比例的優化

由于樣品的基質較雜，合適的洗脫液可使目標物盡可能從柱中洗脫下來，同時減少雜質被洗脫下來，對比研究了不同體積比洗脫液的洗脫效果,結果如圖5所示.由圖5可知，氟環唑的回收率隨著洗脫液體積比的減小先增高后降低，在體積比為7:3時回收率較高，可能是由于洗脫液的極性偏大或偏小，不利于目標物的洗脫凈化，導致氟環唑的回收率較低．

2.6 固相萃取柱選擇

樣品中的基質成分復雜多樣，必須經過凈化處理，不同的萃取柱性能、效果不同，合適的萃取柱可降低檢測器的雜峰干擾，提高回收率．為了最大限度地排除雜質離子的干擾，對比研究了不同種類的固相萃取柱的凈化效果，結果如圖6所示.由圖6可知，Florlisil柱的凈化效果最好．

圖5 洗脫液比例對氟環唑回收率的影響 圖6 萃取柱種類對氟環唑回收率的影響

2.7 標準曲線的繪制

圖7 氟環唑標準曲線 圖8 氟環唑標準溶液氣相色譜圖(1.275 μg/mL)

2.8 響應面分析優化氟環唑的提取條件

(1)響應面試驗因素水平的選擇.實驗根據以上單因素實驗結果，選超聲時間、氯化鈉用量和提取劑體積為主要考察因素，以氟環唑的回收率為指標，設計3因素3水平響應面試驗，選用Design-Expert 8.0軟件中Box-Behnken作為響應面模型．實驗的因素及水平如表1所示．

表1 響應面試驗

(2)響應面實驗設計及結果分析.以A(超聲時間)、B(NaCl用量)、C(提取劑體積)為自變量，氟環唑的回收率為Y(響應值)，以此進行17組分析試驗，其中用以估算誤差中心試驗有5個．BBD的試驗結果如表2所示.根據表2中試驗的結果應用Design-Expert 8.0軟件進行分析，3個自變量模型的方差分析結果如表3所示.由表3可知,模型的F=16.77，P=0.000 6<0.001，表明實驗的二次模型是極顯著的，在統計學上有意義．實驗失擬項P=0.131 4>0.05，對模型有利，無失擬因素，數據中無異常點出現，因此可用于預測各因素與氟環唑回收率的關系．

由Design-Expert 8.0軟件得出各個因素的效應圖如圖9、圖10、圖11所示．由圖9、圖10、圖11可知，圖形的表面有明顯彎曲，可得各個因素對響應值Y是非線性的，A、B、C三個因素水平存在極值點．

(3)響應面回歸模型的建立.結合Design-Expert軟件計算，可得該響應面模型的回歸方程如下：

R=-281.546 25+22.601 25A+205.528 12B+12.283 5C-3.275AB-2.7E-003AC-5.076 25BC-0.629 8A2-42.125B2-0.214 9C2

(4)各因素水平的優化．根據效應圖繪制回歸方程的3D響應面圖，回歸方程存在極值點．為了確證其最佳值，對方程取一階偏導，整理可得：

22.601 25-3.275B-2.7E-003C-1.259 6A=0

205.528 12-3.275A-5.076 25C-48.25B=0

12.283 5-2.7E-003A-5.076 25B-0.425 8C=0

解方程組得A=13.02，B=0.75，C=19.65，代入響應面方程得到氟環唑的最大響應值是87.31．即在超聲時間13 min，NaCl用量0.7 g，提取劑乙腈20 mL時，氟環唑的回收率高達87.31%．

表2 BBD的試驗結果

表3 響應面試驗的方差分析結果

P<0.05時，影響顯著；P<0.01時，影響極顯著，分別用*和**表示

圖9 A和B對氟環唑回收率的影響 圖10 A和C對氟環唑回收率的影響

圖11 B和C對氟環唑回收率的影響

2.9 方法的重復性實驗

準確稱取茶葉樣品，按上述方法進行測定，結果如表4所示．由表4可知，樣品中氟環唑質量濃度的平均值是0.044 7 mg/kg，RSD為3.55%，方法重復性和精密度較好．

表4方法精密度實驗

天數氟環唑/mg·kg-1平均值/mg·kg-1RSD/%10.043220.047130.04330.04473.55

2.10 方法的回收率實驗

分別稱取3份茶葉樣品，在樣品中分別加入0.02 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg 3種質量濃度的氟環唑標準液，以最佳條件進行實驗處理，結果如表5所示.由表5可知，氟環唑在茶葉中的添加回收率范圍為86.38%～92.06%，平均回收率為89.32%，且變異系數范圍為3.06%～5.64%，可見方法的回收率較好．茶葉粉中氟環唑的添加回收色譜圖(加標水平為0.127 5 mg/kg)如圖12所示．

表5 方法的回收率實驗

圖12 氟環唑在茶葉中的添加回收色譜圖

3 結論

SPE-GC測定茶葉中的氟環唑殘留量的實驗中，樣品凈化步驟采用Florlisil柱，應用Design-Expert 8.0優化樣品預處理方法，得到最佳條件下回收率為87.31%，加標回收率在86.38%～92.06%之間，重復性實驗RSD為3.55%，最低檢出限為0.007 μg/mL．實驗操作簡單、快速、穩定，方法的精密度、重現性、靈敏度、回收率、線性關系良好，可用于大量樣品的檢測．