miRNA-497過表達對人結腸癌細胞放療敏感性的影響

白樺,張松,肖鵬,栗敏鄭州人民醫院腫瘤內科,鄭州450000

2鄭州大學第一附屬醫院放療科,鄭州4500000

微小RNA(microRNA,miRNA)作為一類非編碼RNA,通過調節基因轉錄后過程調控器官形態及細胞增殖和凋亡.50%的miRNA位于腫瘤相關的基因組區域或者脆弱位點[1],一些miRNA通過調控原癌基因和抑癌基因的表達,從而在惡性腫瘤的發生、發展及預后中發揮重要作用[2-5].miRNA也可能作為腫瘤診斷和治療的靶向標志物[6].miRNA表達與腫瘤細胞化療和放療敏感性的相關性引起了越來越多的關注[7-10].在膽管上皮癌細胞中,miRNA-21和miRNA-200b增加了吉西他濱的放療敏感性[11].在人胃癌細胞中,miRNA-34也增加了放療的敏感性[12].Caco2細胞作為一種人直腸癌細胞系,其結構和功能類似于人小腸上皮細胞,并含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系,具有相對簡單、重復性較好、應用范圍較廣的特點,因此本研究采用該細胞系作為放療敏感性研究的體外模型.以往研究表明,miRNA-497過表達能抑制胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)3'端非翻譯區的活性,抑制結直腸癌細胞中內源性IGF-1R的表達,提示下調miRNA-497的表達可以使IGF-1R的表達水平升高,從而導致結直腸癌的發生[13].然而,miRNA-497在結腸癌放療敏感性中的作用及其機制尚未研究.本研究探討miRNA-497過表達對人結腸癌細胞放療敏感性的作用及對IGF-1R信號通路的調控作用,旨在為結腸癌的臨床治療提供依據,現報道如下.

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人結腸癌細胞系Caco2購自中國科學院上海生命科學院細胞庫,含有miRNA-497核苷酸序列的過表達載體pGV208慢病毒購自上海吉凱生物化學技術有限公司,IGF-1RsiRNA購自上海英俊生物技術有限公司,DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶和青鏈霉素均購自美國Gibco公司,RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司,逆轉錄試劑盒購自Promega公司,蛋白質印跡(Western blot)顯色劑購自Pierce公司,一抗購自Cell Signalling Technology公司,二抗購自Santa Cruz公司,噻唑藍(methylthiazoletetrazolium,MTT)試劑、甲醛和姬姆薩染料購自Sigma公司.

1.2 細胞培養

使用DMEM培養基(含有10%胎牛血清、1000U/ml青鏈霉素)培養人結腸癌Caco2細胞,置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱內,每2～3天更換培養液,待細胞融合至80%左右,使用胰蛋白酶消化細胞,進行傳代培養.

1.3 細胞轉染

轉染含有miRNA-497核苷酸序列的慢病毒至Caco2細胞作為miRNA-497轉染組,轉染含有一段無義寡核苷酸序列的重組慢病毒至Caco2細胞作為陰性對照組,以不作處理的Caco2細胞作為空白對照組.

1.4 miRNA-497半定量檢測

由于載體pGV208含有增強型綠色熒光蛋白,轉染72 h后顯微鏡下可觀察到細胞有明顯熒光表達.收集轉染成功的miRNA-497轉染組細胞及陰性對照組和空白對照組細胞,應用Trizol提取總RNA.使用M-MLV逆轉錄酶對目的基因和內參基因U6進行逆轉錄.miRNA-497逆轉錄引物:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3';U6逆轉錄引物:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'.再將轉錄后的cDNA采用SYBR Green熒光染料,以U6RNA作為內參,進行熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR),每個樣品重復3次.miRNA-497上游引物為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3',miRNA-497下游引物為5'-TAGCCTGCAGCACACTGTGGT-3';U6上游引物為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',U6下游引物為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'.對3次重復實驗的數據進行半定量分析.

1.5 細胞克隆形成實驗

釆用Varian 2300EX直線加速器6MV-X線垂直輻射結腸癌細胞(上蓋1 cm有機玻璃填充物),劑量率為3.2 Gy/min,源皮距(source skin distance,SSD)為100 cm.將放射處理后的對數生長期細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液,細胞計數后接種于細胞培養皿中培養10～14天.待出現集落時終止培養.棄培養液,甲醛固定15 min,姬姆薩染色10 min,統計細胞數>50個的集落數.對應照射劑量為0、2、4、6、8 Gy,每孔所接種的細胞數為600、1000、2000、5000、10 000.每個劑量做3個平行復孔.根據單靶多擊模型擬合細胞存活曲線,并計算放射增敏比.

1.6 MTT法檢測細胞增殖抑制率和存活率

將照射后的細胞經0.25%的胰蛋白酶消化,按每孔1X103個細胞均勻接種于96孔培養板,每個條件設3個復孔,培養4天后,每孔加入20 μl MTT,37℃繼續孵育4 h,加入DMSO后在570 nm波長下測定光吸收值A,計算細胞增殖抑制率和存活率.細胞增殖抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/實驗組A值X100%,細胞存活率=實驗組A值/對照組A值X100%.

1.7 Western blot檢測蛋白表達

收集待測細胞,加入細胞裂解液提取總蛋白后,參照BCA蛋白定量試劑盒說明書對所提取的總蛋白進行定量.將定量合格的蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混合后,置于沸水浴中變性5 min.將變性后的蛋白樣品以每孔50 μg上樣至10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠孔中,電泳2 h后電轉印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上.將含有蛋白樣品的PVDF膜浸泡入含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h.封閉液洗膜10 min,3次后,與1∶1000稀釋的特異性一抗4℃反應24 h,以1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育1 h.封閉液再次洗膜后,加入化學發光劑,暗室內顯影曝光,凝膠成像系統掃描分析.

1.8 IGF-1 R siRNA轉染實驗

為驗證miRNA-497是否通過IGF-1R調節Caco2細胞的放射敏感性,以轉染IGF-1RsiRNA的Caco2細胞作為IGF-1RsiRNA轉染組,以未轉染的Caco2細胞作為空白對照組.采用熒光定量PCR和Western blot檢測IGF-1R的表達水平,采用MTT實驗檢測細胞存活率.

1.9 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件對-數據進行統計分析,計量資料以均數±標準差()表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 miRNA-497表達水平的比較

miRNA-497轉染組的miRNA-497表達水平為(6.45±0.62),高于陰性對照組的(1.18±0.25)和空白對照組的(1.00±0.08),差異均有統計學意義(P<0.05).陰性對照組和空白對照組的miRNA-497表達水平比較,差異無統計學意義(P>0.05).

2.2 克隆形成率和存活率的比較

照射劑量為2、4、6、8 Gy時,miRNA-497轉染組細胞的克隆形成率均低于空白對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)(表1);照射劑量為2、4、6、8 Gy時,miRNA-497轉染組細胞的存活率均低于空白對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)(表2).采用單擊多靶模型進行曲線擬合,放射增敏比=1.533.

表1 空白對照組和miRNA-497轉染組應用不同劑量 X射線照射后細胞的克隆形成率(%,±s)

表1 空白對照組和miRNA-497轉染組應用不同劑量 X射線照射后細胞的克隆形成率(%,±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

組別空白對照組miRNA-497轉染組74.5±6.2 63.4±2.6 48.6±5.3 25.6±3.1*30.6±3.7 5.4±1.1*14.7±1.7 1.3±0.3*6.3±0.3 0.3±0.0*0 Gy 2 Gy 4 Gy 6 Gy 8 Gy

表2 空白對照組和miRNA-497轉染組應用不同劑量 X射線照射后細胞的存活率(%,±s)

表2 空白對照組和miRNA-497轉染組應用不同劑量 X射線照射后細胞的存活率(%,±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

組別空白對照組miRNA-497轉染組0 Gy 100.0±0.0 100.0±0.0 2 Gy 92.3±6.7 74.8±5.8*4 Gy 58.1±4.9 15.8±1.0*6 Gy 27.9±3.2 3.8±0.5*8 Gy 12.0±0.1 0.9±0.2*

2.3 細胞增殖抑制率的比較

MTT檢測結果顯示,隨著照射劑量的增加,各組細胞的增殖抑制率逐漸升高.照射劑量為2 Gy時,miRNA-497轉染組細胞的增殖抑制率高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05);照射劑量為4、6、8 Gy時,miRNA-497轉染組細胞的增殖抑制率均明顯高于空白對照組,差異均有統計學意義(P<0.01).照射劑量為2、4、6、8 Gy時,陰性對照組與空白對照組細胞的增殖抑制率比較,差異均無統計學意義(P>0.05).(圖1)

2.4 細胞存活率的比較

采用4 Gy/min劑量率垂直輻射Caco2細胞后,觀察72 h后的細胞存活率,結果顯示3組細胞的存活率均隨處理時間的延長而下降.處理24、48、72 h后,miRNA-497轉染組的細胞存活率均低于空白對照組,差異均有統計學意義(P<0.05);但陰性對照組與空白對照組細胞的存活率比較,差異均無統計學意義(P>0.05).(表3)

表3 不同時間點 3組細胞存活率的比較(%,±s)

表3 不同時間點 3組細胞存活率的比較(%,±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

組別空白對照組陰性對照組miRNA-497轉染組100.00±7.55 96.48±5.24 65.75±3.26*88.95±5.22 82.05±6.38 37.58±3.36*79.08±6.85 75.16±3.28 34.28±2.72*24 h 48 h 72 h

2.5 IGF-1 R、p-AKT、AKT蛋白表達水平的比較

Western blot結果顯示,miRNA-497轉染組的IGF-1R和p-AKT蛋白表達水平均低于空白對照組,差異均有統計學意義(P<0.05).(表4)

表4 不同組別IGF-1 R、p-AKT、AKT蛋白表達水平的比較(±s)

表4 不同組別IGF-1 R、p-AKT、AKT蛋白表達水平的比較(±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

組別空白對照組陰性對照組miRNA-497轉染組IGF-1R 1.00±0.08 0.96±0.06 0.58±0.05*p-AKT 1.00±0.09 0.94±0.07 0.62±0.06*AKT 1.00±0.08 0.94±0.06 0.96±0.05

2.6 轉染IGF-1 R siRNA對IGF-1 R表達水平及細胞存活率的影響

IGF-1RsiRNA轉染組中IGF-1R的mRNA和蛋白表達水平分別為(0.58±0.05)和(0.26±0.03),均低于空白對照組的(1.00±0.08)和(0.65±0.05),差異均有統計學意義(P<0.05).4 Gy/min劑量率垂直輻射Caco2細胞后,觀察處理48 h后的細胞存活率,MTT檢測結果顯示,IGF-1RsiRNA轉染組的細胞存活率為(63.52±5.05)%,低于空白對照組的(89.06±6.22)%,差異有統計學意義(P<0.05).

3 討論

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發病率居所有惡性腫瘤的第3位,在中國其發病率與病死率均呈逐年上升趨勢,發生遠處轉移的結直腸癌患者的5年生存率僅為6%～8%[14],但是關于結直腸癌發生的分子機制目前尚未明確.

miRNA作為一類普遍存在于細胞中的長度為21～24個核苷酸的內源性非編碼小RNA,參與了基因表達的轉錄后調節過程,通過結合靶向mRNA轉錄子的互補位點調節基因表達水平[15].miRNA在腫瘤的發生、發展、轉移和侵襲等過程中發揮著重要的調節作用[16-17].miRNA直接參與結直腸癌的發生和發展,其通過調節抑癌基因信號通路,在結直腸癌的發生過程中發揮重要作用.研究表明,miRNA-135a、miRNA-135b和miRNA-122a能使腺瘤性結腸息肉(adenomatous polyposis coli,APC)抑癌基因及其介導的信號通路失活[18-20];在APC突變的小鼠模型中,miRNA-31、miRNA-137和miRNA-215不同程度地影響結直腸癌的發生,表明這些miRNA通過調節APC信號通路參與了結直腸癌的早期發生過程.miRNA-34、miRNA-145和miRNA-107分別通過調節p57參與了腫瘤細胞的生長、增殖及血管生成[21].因此,miRNA通過調節APC信號通路參與結腸癌的發生過程,而通過調節p57信號通路參與腫瘤的侵襲過程,并且近年來的研究表明,miRNA參與了結直腸癌的轉移[22-23].

miRNA-497是近年研究的熱點,它可以通過調控細胞周期而參與細胞凋亡,其在腫瘤組織中呈現過表達,而且與腫瘤的發生發展密切相關.miRNA-497屬于miRNA-15/16/195/424/497家族成員,通過靶向結合CDK6、CARD10和CDC27基因調控結腸癌細胞的增殖[24].在不同的細胞系中,該家族的miRNA通過靶向調節Bcl-2促進細胞凋亡[25-26].然而到目前為止,miRNA-497與結腸癌放療敏感性的關系暫無相關報道.為此,本研究利用慢病毒構建了miRNA-497過表達的Caco2細胞系,并以其為研究對象利用不同方法觀察miRNA-497對放療敏感性的影響.細胞克隆形成實驗結果表明,miRNA-497轉染組細胞的放射抗拒性明顯降低,結腸癌細胞的克隆形成率明顯降低.MTT實驗結果表明,miRNA-497轉染組與空白對照組相比,經放射處理后細胞存活率明顯下降,并且細胞存活率隨著處理時間的延長而下降,提示miRNA-497過表達可以提高結腸癌對放射線的敏感性.

miRNA通過調節AKT相關信號通路從而影響腫瘤細胞的放療敏感性.miRNA-21、miRNA-26、miRNA-221/222、miRNA-216a/217和miRNA-486共同通過調節抑癌基因PTEN的表達,進一步調控AKT酶的活性.miRNA-155、miRNA-205和miRNA-375分別通過調節SHIP和PDK1基因的表達,激活AKT酶的活性.miRNA-126和miRNA-320通過調控磷脂酰肌醇3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)的表達,影響下游三磷酸磷脂酰肌醇和AKT酶及其磷酸化水平[27-28].MyoD和MRTF-A通過結合于miRNA-486的啟動子區域激活了該miRNA的轉錄,成熟的miRNA-486直接抑制PI3K/AKT信號通路中兩個重要的負調節因子PTEN和Foxo1a,從而激活AKT信號通路.miRNA-221和miRNA-222靶向作用于PTEN蛋白,從而調節腫瘤細胞的生長、增殖、凋亡、侵襲、轉移和放療敏感性[27].研究顯示,IGF-1R蛋白是miRNA-497調控的關鍵靶分子[15].本研究結果表明,Caco2細胞中過表達miRNA-497抑制了AKT的磷酸化水平,從而降低AKT酶的活性.表明miRNA-497可能通過抑制AKT的磷酸化水平和IGF-1R蛋白表達,從而增強Caco2細胞的放療敏感性.因此推測miRNA-497增強結腸癌細胞的放療敏感性可能是通過PI3K/AKT信號通路而實現的.作為威脅人類健康最重要的惡性腫瘤之一,結直腸癌的早期診斷和早期治療越來越受到人們的重視.在治療方面,手術治療是結直腸癌的首選治療方法,在手術基礎上輔以化療、放療等一系列綜合治療手段,已成為結直腸癌治療的研究熱點.本研究結果表明,miRNA-497增強了結腸癌細胞的放療敏感性,為結腸癌的臨床輔助治療提供了依據.然而,在腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲和轉移過程中,往往存在多種基因網絡或信號通路的共同參與.miRNA-497不僅可以調控PI3K/AKT信號通路,在腫瘤細胞中還可以調控其他蛋白的表達[16-17],因此還需要對結腸癌的放療敏感性調控網絡進行深入研究.

本研究對miRNA-497在結腸癌放療敏感性中的作用進行了初步闡明,并對其調控機制進行了研究,過表達miRNA-497可通過靶向抑制PI3K/AKT通路增加Caco2細胞的放療敏感性,這為miRNA-497作為靶向藥物提供了有價值的實驗證據.