泛素特異性蛋白酶 9 X在非小細胞肺癌中的表達情況及與患者預后的關系

吳疇斌,方志明,王煒,郝名浩

廈門大學附屬東南醫院(解放軍第一七五醫院)腫瘤內科,福建漳州3630000

泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease,USP)家族是去泛素化酶家族中成員最多且結構最具多樣性的一類.泛素特異性蛋白酶9X(ubiquitin-specific peptidase 9 X-linked,USP9X)即X染色體連鎖的泛素特異性蛋白酶,定位于X染色體p11.4位點,基因全長150 945 bp,編碼2554個氨基酸殘基.盡管已有研究表明USP9X對部分腫瘤的進展及預后具有一定的作用,但USP9X與非小細胞肺癌患者預后的關系目前仍不明確[1-3].本研究探討了非小細胞肺癌組織和正常肺組織中USP9X的表達情況及其臨床意義,旨在分析USP9X與非小細胞肺癌患者預后的關系,現報道如下.

1 資料與方法

1.1 標本來源

收集2011年7月至2016年7月于廈門大學附屬東南醫院經外科手術切除的95例非小細胞肺癌組織標本,另收集32例癌旁正常肺組織標本作為對照.95例患者中,男76例,女19例;年齡20～80歲,>60歲46例,≤60歲49例;無吸煙史33例,有吸煙史62例;病理類型:腺癌42例,鱗癌46例,腺鱗癌7例;分化程度:中高分化64例,低分化31例;腫瘤直徑>5 cm 56例,腫瘤直徑≤5 cm 39例;有淋巴結轉移49例,無淋巴結轉移46例;TNM分期:Ⅰ期27例,Ⅱ期26例,Ⅲa期42例;具有化療和(或)放療指征的患者均在術后接受了以鉑類為基礎的雙藥化療方案,其中10例Ⅱ期患者、26例Ⅲa期患者術后接受了胸部放射治療.

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組織化學染色步驟將石蠟切片置于62℃烘箱中,烘片1 min;二甲苯中脫蠟10 min,100%～30%乙醇(每種乙醇按照5%濃度下降)各5 min,然后在過氧化物酶抑制藥中浸泡10 min,除去內源性過氧化物酶活性,然后蒸餾水沖洗3次,每次3 min后倒掉試劑,清水沖洗2次.置于pH 6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中,加熱至沸騰(溫度最好為98～100℃),冷卻15 min,反復2次,修復過程中注意防止溫度驟冷導致石蠟切片在染色過程中出現脫片現象.取出容器,置于室溫下20 min以充分暴露固定在組織中的抗原,從緩沖液中取出切片,冷卻,蒸餾水沖洗3次.在pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)中浸泡5 min,重復2次后用蒸餾水沖洗3次.擦去組織周圍的PBS液,滴加正常羊血清封閉,37℃孵育10 min.除去羊血清液,按照1∶100的比例滴加兔抗USP9X多克隆抗體(購自Abcam公司),4℃冰箱孵育過夜.PBS沖洗3次,每次3 min.按照1∶200的比例滴加生物素標記的二抗羊抗兔IgG,37℃孵育15～20 min,PBS沖洗3次,每次3 min.滴加過氧化物酶標記的鏈霉素抗生物素蛋白,37℃孵育15～20 min,PBS沖洗3次,每次5 min.于切片上滴加3,3-二氨基聯苯胺(3,3-aminobenzidine,DAB)溶液,顯色5 min,然后用自來水、蒸餾水沖洗干凈.Harris蘇木精復染細胞核2 min,自來水沖洗.梯度酒精(70%、80%、90%、95%、100%)逐級脫水,各3 min,二甲苯透明20 min.用中性樹脂滴在組織旁邊,用蓋玻片蓋上,輕輕放平一側后再放另一側,避免產生氣泡,封好片子后置于通風柜中晾干.

1.2.2 免疫組織化學染色結果分析由兩位病理醫師采用雙盲法進行判定.根據陽性細胞百分比進行評分:陽性細胞百分比為1%～10%,記為0分;陽性細胞百分比為11%～50%,記為1分;陽性細胞百分比為51%～80%,記為2分;陽性細胞百分比>80%,記為3分.根據染色強度進行評分:未染色為0分,輕度染色為1分,中度染色為2分,重度染色為3分.根據陽性細胞百分比評分與染色強度評分之和,將0～3分定義為陰性表達(-),4～5分定義為弱陽性表達(+),6～7分定義為強陽性表達(++).將非小細胞肺癌患者分為兩組:USP9X低表達組(0～5分)和USP9X高表達組(6～7分).

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析.計數資料以率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗;等級資料的比較采用秩和檢驗;單因素和多因素分析采用Cox比例風險回歸模型.以P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 USP 9 X在非小細胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中的表達情況

USP9X高表達主要見于細胞質中.癌旁正常肺組織中,USP9X陰性表達僅見于基底層細胞,而在上皮棘層細胞,USP9X則呈弱陽性表達(圖1A、1B).非小細胞肺腺癌組織中,USP9X的表達呈逐層上升(圖1C、1D);非小細胞肺鱗癌組織中,這一現象同樣存在(圖1E、1F).非小細胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中USP9X的表達情況比較,差異有統計學意義(Z=5.788,P<0.01)(表1).

表1 非小細胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中USP 9 X的表達情況[n(%)]

2.2 USP 9 X表達情況與非小細胞肺癌患者臨床特征的關系

有淋巴結轉移、Ⅲa期非小細胞肺癌患者的USP9X強陽性表達率均明顯高于無淋巴結轉移、Ⅰ～Ⅱ期的患者,差異均有統計學意義(P<0.01).不同年齡、性別、吸煙情況、病理類型、分化程度和腫瘤直徑的非小細胞肺癌患者的USP9X強陽性表達率比較,差異均無統計學意義(P>0.05).(表2)

表2 USP 9 X強陽性表達率與非小細胞肺癌患者臨床特征的關系(n=95)

2.3 非小細胞肺癌患者預后的影響因素分析

單因素分析結果顯示,非小細胞肺癌患者的生存預后可能與淋巴結轉移情況、TNM分期和USP9X表達情況有關(P<0.01).多因素分析結果顯示,TNM分期和USP9X表達情況是非小細胞肺癌患者生存預后的獨立影響因素(P<0.05).(表3、表4)

表3 95例非小細胞肺癌患者預后影響因素的單因素分析

表4 95例非小細胞肺癌患者預后影響因素的多因素分析

3 討論

研究表明,USP9X在非小細胞肺癌組織中過表達[4-5].本研究結果顯示,非小細胞肺癌組織中USP9X的陽性表達率高于正常肺組織,與上述文獻報道結果一致.

本研究分析了USP9X表達情況與非小細胞肺癌患者臨床特征的關系,結果表明,有淋巴結轉移、Ⅲa期非小細胞肺癌患者的USP9X陽性表達率均明顯高于無淋巴結轉移、Ⅰ～Ⅱ期的患者,差異均有統計學意義(P<0.01).不同年齡、性別、吸煙情況、病理類型、分化程度和腫瘤直徑的非小細胞肺癌患者的USP9X陽性表達率比較,差異均無統計學意義(P>0.05).結果提示USP9X在非小細胞肺癌的進展和轉移中起重要作用.Peng等[6]研究表明,USP9X在食管鱗狀細胞癌患者中同樣存在過表達,但不同分化程度患者的USP9X表達情況比較,差異無統計學意義(P=0.147).研究顯示,不同分化程度的非小細胞肺癌患者的USP9X表達不同可能與患者的病理分型有關系[7-8].

USP9X過表達作為預后較差的因素已在部分腫瘤細胞如多發性骨髓瘤[9]、胰腺導管腺癌[10]中被證實.本研究的多因素分析結果顯示,USP9X表達水平越高,患者的總生存期越短,USP9X的表達情況是非小細胞肺癌患者生存預后的獨立影響因素(HR=2.24,P=0.028).Peng 等[6]研究表明,在食管鱗狀細胞癌中,USP9X表達升高會致使患者的總生存期變短.Schwickart等[9]研究表明,在多發性骨髓瘤中,USP9XmRNA表達增加會導致腫瘤患者預后不良.而在另一項胰腺導管腺癌的研究中,USP9X蛋白低表達卻與患者的生存率呈負相關,USP9X蛋白表達水平越低,預后越差[10].也許這些截然相反的結果可以解釋USP9X蛋白表達在腫瘤發生中的作用,以及在不同器官或者同一器官不同發展階段中的作用.USP9X高表達后可以調節某些基因如Mcl-1、β-catenin、TGF-β的表達,從而參與腫瘤的增殖、侵襲和轉移.研究表明,在腫瘤組織中USP9X的表達會直接影響抗凋亡家族Bcl-2中Mcl-1的表達,且USP9X抑制藥WP1130可以促進Mcl-1表達下調,提高腫瘤細胞對化療的敏感性,這或許是造成USP9X具有致癌功能及導致腫瘤預后不良的原因[9].在淋巴瘤中,USP9X通過去泛素化的方式穩定抗凋亡家族Bcl-2中Mcl-1的表達,其結果是淋巴瘤患者的死亡率升高,進一步研究顯示,沉默USP9X可使腫瘤增長速度減緩,但斷裂Mcl-1的48位賴氨酸多聚泛素鏈,會使Mcl-1蛋白穩定減弱,有利于細胞生存[11].

研究發現,USP9X在活躍細胞中能夠影響并穩定β-catenin的表達,推測其可能是通過去泛素化途徑對β-catenin起作用[12].在非小細胞肺癌的細胞質或細胞核中,β-catenin的表達程度與其不良預后有關,進一步證實β-catenin是非小細胞肺癌的獨立預后因素[13].然而,造成這一現象是否由于非小細胞肺癌中高表達的USP9X使得Wnt/β-catenin信號通路活化,還需進一步研究.同時,USP9X可能參與另一個與腫瘤關聯的信號通路TGF-β,無論是促進還是抑制TGF-β信號通路,相應的致癌基因和腫瘤抑制功能都發生改變,證實改變USP9X的表達可導致多種器官中TGF-β基因的改變[14].USP9X究竟是作為致癌基因還是抑癌基因,取決于腫瘤類型及分期.但對于USP9X基因表達與轉錄調節機制的研究卻很少.既往研究發現,USP9X有可能作為p53的靶基因[15].除了基因表達發生改變外,USP9X被替換可通過外顯子組及再循環檢測被檢查出來.已被了解的86種腫瘤基因組學中,轉移或數量發生改變的占據53種,而在這些腫瘤中,USP9X作為唯一發生改變因素的腫瘤高達13%;USP9X表達改變的發生率在其他惡性腫瘤中更高,如在口腔鱗狀細胞癌患者樣本中就發現有22%[16].

綜上所述,USP9X在非小細胞肺癌組織中的表達水平高于正常肺組織,TNM分期和USP9X表達情況是非小細胞肺癌患者生存預后的獨立影響因素,USP9X表達水平越高,患者預后越差.