超聲波處理下苦蕎麥萌發及富集黃酮工藝優化研究

卞紫秀，汪建飛，王順民

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

苦蕎麥(Fagopyrum Tataricum)為雙子葉蓼科蕎麥屬植物，為“食藥兩用”的糧食珍品.苦蕎麥營養豐富，含有極為豐富的生物活性成分——黃酮類化合物.其萌發后黃酮類物質尤其是蘆丁含量可成倍增加，營養價值和生物活性顯著提高[1].研究表明，磁場、電場和超聲波會對植物組織表現出一定的誘導效應[2]，從而對萌發胚芽生長有調控作用[3-4].超聲波是一種頻率高于20 kHz的機械波，其具有的“空洞效應”可有效刺激種子[5]，使植物種子產生一些特殊效應，從而引發一系列生理生化變化[6]，促進生長并縮短作物的成熟期[7-8].該特殊作用已引起了越來越多的谷物研究學者的關注[9].有研究表明，超聲波處理能有效激活植物種子萌發期的各種酶類的活性[10]，顯著提高種子萌發率及誘導種子中一些生物活性成分的合成[11-12].目前，有關超聲波預處理刺激谷物種子以富集黃酮類化合物的研究較少[11-12].超聲波作為一種安全高效的物理刺激手段來處理種子和植株幼苗目前已得到廣泛的應用，但是過高強度的超聲波處理種子和幼苗可能會使細胞破裂，酶失活，而且不同農作物對超聲波的感應條件也不一樣.因此超聲波處理種子促進萌發和富集活性物質仍需進一步研究.就不同超聲波處理對苦蕎麥種子的萌發及其萌發過程中黃酮類物質含量的變化的影響，以及苦蕎麥萌發的最適超聲波處理條件做了探究，為苦蕎麥產品開發提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

(1)試驗材料及藥品.苦蕎麥(寧夏鹽池縣種子公司)；次氯酸鈉、高錳酸鉀、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司).

(2)試驗器材.光照種子發芽箱(YRG-150，上海合恒儀器設備有限公司)；超聲波清洗機(JK-400CDB，合肥金尼克機械制造有限公司)；冷凍離心機(TGL-16A，長沙平凡儀器儀表有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9023，上海三發科學儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(UV-5800PC，上海元析儀器有限公司)；大容量離心機(L-550，湖南湘儀離心機儀器有限公司).

1.2 實驗方法

(1)苦蕎麥種子預處理.選擇顆粒飽滿、粒大的苦蕎麥種子，用清水沖洗干凈，以1.0 g/L高錳酸鉀溶液[7]浸泡消毒5～10 min，用清水洗滌至澄清.轉入25 ℃純凈水中浸泡4 h，期間換水一次.后將種子置于50 ℃～60 ℃溫水中催芽15 min.將種子(每組50粒)置于10 cm培養皿，進行超聲波處理.

(2)超聲波處理.①預處理后的種子分別在功率為200 W、240 W、280 W、320 W、360 W和400 W，溫度為20 ℃下，超聲波處理30 min.②預處理后的種子在功率為280 W，溫度為20 ℃下，分別超聲波處理10 min、15 min、20 min、25 min、30 min和35 min.③預處理后的種子在功率為280 W，溫度分別為15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃，超聲波處理35 min.同時進行對照試驗(CK為未經超聲波處理種子).

(3)種子萌發.將經超聲波處理后的種子均勻平鋪在內襯雙層濾紙的直徑為10 cm的培養皿中，于全自動種子發芽箱中進行避光培養，在25 ℃，濕度為75%～85%條件下培養7 d，每12 h淋澆一次水，一次澆水量為8 mL左右至第7 d結束.每12 h統計萌發種子數[8].取生長期為2 d和4 d的苦蕎麥芽苗稱重、研磨，后測定各指標.

1.3 實驗指標及測定方法

(1)萌發率.自開始培養起，每隔12 h，依次測量其萌發率(胚軸突破種皮1 mm即為萌發)，連續測定7 d，每組重復3次，直至個別處理組萌發率達到100%.測定初始萌發率和最終萌發率[11].其中萌發12 h時萌發率為0.

(2)總黃酮.采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮含量.將一定量的蕎麥芽置于研缽中，加少量石英砂，以60%的乙醇進行研磨、提取，提取液用冷凍離心機在9 000 r/min下離心15 min，取上清液進行總黃酮測定(按干重計)[11].通過繪制蘆丁的標準曲線，折算為黃酮含量.繪制標準曲線為y=10.03x-0.002 9.R2為0.999.

(3)響應面試驗.在單因素實驗基礎上，考慮超聲波處理對萌發率和總黃酮含量的影響，研究采用Design-Expert 8.05軟件，以功率(A)、時間(B)和溫度(C)3個因素為自變量，以總黃酮含量(Y)為響應值，設計響應面優化試驗，以確定最佳方案.響應面分析因素與水平設計如表1所示.

表1 響應面分析因素與水平

1.4 數據處理

試驗數據為3次重復，結果以平均值±標準差表示.采用SPSS 18.0統計分析軟件對其進行One-way方差分析(ANOVA)，并用Duncan's復相關試驗法進行均值差異性的相關分析，顯著性水平p≤0.05.

2 結果及分析

2.1 超聲波處理對苦蕎麥種子萌發率及黃酮含量的影響

(1)超聲波功率對苦蕎麥種子萌發率的影響如圖1所示.從圖1可以看出，超聲波的功率會影響苦蕎麥種子的萌發率，低功率處理可以增加萌發率，高功率反之.其中萌發12～36 h時240 W功率處理下的種子萌發率最高，萌發48 h時，當超聲波功率由160 W增加到400 W，萌發率隨功率增加而降低.萌發60～72 h時，在超聲波160～360 W功率處理下苦蕎種子的萌發趨勢平穩，但當萌發超過84 h時，萌發率隨超聲波功率增加而降低.超聲波的功率會影響苦蕎麥種子的萌發率，低功率處理可以促進萌發而高功率會抑制萌發.超聲波震蕩的作用在產生種殼碎片的同時促進了水化過程，即提高了種子吸水率，又可有效改變酶分子結構，促進酶的催化作用達到加速種子萌發的效果[7-8].Yaldagard[7]等人發現用20%～90%的460 W超聲波功率處理大麥種子5～15 min，可使最終萌發率增加1.042～1.065倍，萌發期縮短30%～45%.根據實驗結果，選擇280～360 W進行后續研究.

(2)超聲波時間對苦蕎麥種子萌發率的影響如圖2所示.從圖2可以看出，超聲波處理時間的長短會影響苦蕎麥種子的萌發率.隨著處理時間的延長，萌發率呈增加趨勢.短時間超聲波處理可以促進萌發，但效果不明顯，處理35 min時萌發率明顯高于對照,故選擇處理時間為25～35 min進行后續研究.由圖2還可以看出，超聲波時間會影響苦蕎麥種子的萌發率，隨著超聲波處理時間的延長，萌發率呈增加趨勢，短時間處理(低于15 min)促進萌發效果不明顯.

圖1 超聲波功率對苦蕎麥種子萌發率的影響 圖2 超聲波時間對苦蕎麥種子萌發率的影響

(3)超聲波溫度對苦蕎麥種子萌發率的影響如圖3所示.從圖3可以看出，超聲波處理的溫度會影響苦蕎麥種子的萌發率，當溫度由15 ℃升高到40 ℃，萌發率隨處理溫度的升高呈先減少后增加的趨勢.低溫下處理對種子萌發的刺激作用不強，適當升高溫度則有利于激活種子的相關酶的活性而促進種子萌發.萌發24～36 h時，萌發率隨超聲溫度增加先升高后降低，48 h時萌發率隨超聲溫度升高趨勢比較穩定，但25 ℃時略有降低，而萌發60 h時，15 ℃～30 ℃下萌發率差異不顯著，溫度超過30 ℃后，萌發率增加，但是與對照差異不顯著.萌發72～84 h時，不同超聲溫度下萌發率趨勢穩定.超聲波溫度均會影響苦蕎麥種子的萌發率.當溫度由15 ℃升高到40 ℃，萌發率隨超聲處理溫度的升高呈先減少后增加的趨勢.因為低溫下處理對種子萌發的刺激作用不強，適當升高溫度則有利于激活種子的相關酶的活性從而促進種子萌發.故選擇溫度為20 ℃～35 ℃進行研究.

(4)超聲波功率對苦蕎麥芽苗總黃酮含量的影響．不同超聲波功率下萌發2 d和4 d苦蕎麥中總黃酮含量如圖4所示.從圖4可知，隨著超聲波功率的增加，萌發2 d后的苦蕎麥芽苗中的總黃酮含量整體呈現先增加后降低的趨勢，但都低于種子中黃酮的含量.功率為240～320 W時，總黃酮含量較高.功率為320 W時總黃酮含量達2.152±0.02 g/100 g.從圖4可知，萌發4 d后的苦蕎麥芽苗中的總黃酮含量呈先增加后降低的趨勢.功率為280 W時，總黃酮含量最高，達4.76 g/100 g，分別比種子和CK增加64.98%和56.82%.適當的超聲波處理有助于種子中黃酮類物質的增加，但是功率過高則不利于黃酮類物質的積累.原因為超聲波處理激活了與黃酮類物質合成相關的酶[13]，導致含量顯著增加.故選擇280～320 W作為超聲波功率處理范圍.

圖3 超聲波溫度對苦蕎麥種子萌發的影響 圖4 不同超聲波功率下萌發2 d和4 d的苦蕎麥中總黃酮含量

(5)超聲時間對苦蕎麥芽苗總黃酮含量的影響.不同超聲時間下萌發2 d和4 d的苦蕎麥中總黃酮含量如圖5所示.從圖5可以看出，超聲波處理的時間顯著影響萌發后苦蕎芽苗中總黃酮含量.超聲時間為30 min時萌發4 d的苦蕎芽苗中總黃酮含量達4.770±0.02 g/100 g，分別比種子和CK增加65.40%和57.22%.一定超聲波功率下處理一定時間有助于種子中黃酮類物質的增加，但是隨著時間的延長，其黃酮類物質的含量增加不再顯著.植物生長過程中，種子中合成次生代謝物的相關酶的活性會在超聲波的刺激下，隨著萌發時間的延長而提高，從而使黃酮含量隨萌發天數增加(由2 d增加4 d)而升高.故選擇25～35 min作為最佳的時間優化范圍.

(6)超聲溫度對苦蕎麥芽苗總黃酮含量的影響.不同超聲溫度下萌發2 d和4 d的苦蕎麥中總黃酮含量如圖6所示.從圖6可以看出，超聲波處理溫度顯著影響苦蕎芽苗中總黃酮含量.當溫度為30 ℃時，萌發4 d的芽苗中總黃酮含量達4.488±0.18 g/100 g，分別比種子和CK增加55.62%和47.92%.處理溫度升高處理有助于種子中黃酮類物質的增加，但是溫度升高到一定范圍時，其黃酮類物質的含量增加趨勢變緩，溫度過高則抑制了黃酮類物質的合成.因為合成黃酮類物質的相關酶具有最適溫度，超聲溫度影響了其酶的最適溫度.故選擇20 ℃～35 ℃作為溫度的優化范圍.

圖5 不同超聲時間下萌發2d和4d的苦蕎麥中總黃酮含量 圖6 不同超聲溫度下萌發2 d和4 d的苦蕎麥中總黃酮含量

2.2 苦蕎麥超聲波處理工藝優化

(1)響應面優化的實驗結果及分析.根據響應面試驗CCD設計原理，響應面試驗方案及結果如表2所示.由表2可知，其中1～12為析因試驗，13～17為5個中心試驗，用以估計試驗誤差.萌發4 d的芽苗中黃酮含量較高且芽苗生長高度適宜，故以萌發4 d的芽苗中總黃酮物質的含量為對象進行工藝優化.

表2 CCD響應面實驗設計及測定結果

超聲波處理的回歸分析如表3所示.由表3可知，該回歸方程模型顯著.模型的一次項超聲波功率(A)極其顯著，超聲波時間(B)和溫度(C)顯著.二次項超聲波時間*溫度(BC)顯著.模型復相關系數R2=0.93，變異系數為3.56，說明該模型相關性較好，可用于對超聲波處理下苦蕎麥種子萌發工藝參數進行分析和預測.響應面分析結果如圖7、圖8、圖9所示.

表3 超聲波處理的回歸分析

(2)回歸方程及參數分析.采用Design-Expert 8.05對響應值與各因素進行回歸擬合并修正后，得到回歸方程：

Y(總黃酮含量)=-5.689 53-0.003 1A+0.340B+0.172C+0.003 6BC-0.006 1B2-0.005 8C2.

由圖7、圖8、圖9可知，苦蕎麥萌發過程中總黃酮含量隨微波功率增加而增加，但隨時間的延長先增加后降低.當時間為30 min時，總黃酮含量達到峰值，然后隨時間延長而降低，且功率與時間有交互作用(p>0.05).由圖8可知，苦蕎麥萌發過程中總黃酮含量隨溫度的升高先增加后降低.當溫度為30 ℃時，總黃酮含量達到峰值，然后隨溫度的升高而降低，且功率與溫度有交互作用(p>0.05).由圖9可知，苦蕎麥萌發過程中總黃酮含量均隨溫度和時間的升高，呈先增加后降低的趨勢.當溫度為30 ℃，時間為30 min時，總黃酮含量達到峰值，然后降低，且時間與溫度有交互作用，其作用顯著(p<0.05).

圖7 超聲波功率與時間交互時萌發4 d的苦蕎麥中總黃酮含量響應面圖

圖8 超聲波功率與溫度交互時苦蕎麥萌發4 d中總黃酮量響應面圖

圖9 超聲波時間與溫度交互時苦蕎麥萌發4 d中總黃酮含量響應面圖

根據Design-Expert 8.05軟件對不同超聲波處理苦蕎麥種子的最佳工藝參數回歸方程擬合優化后，得出超聲波處理苦蕎麥種子萌發的最佳工藝為超聲波功率316 W、時間29.26 min和溫度28.44 ℃.為便于實驗，將最佳工藝優化后取為超聲波功率320 W、時間30 min和溫度29 ℃.在此條件下萌發4 d的苦蕎麥種子中總黃酮含量較高，達8.24±0.32 g/100 g，比種子和對照增加1.857倍和0.478倍.研究中，超聲時間為30 min時萌發4 d的苦蕎芽苗中總黃酮含量分別比種子和CK增加65.40%和57.22%.超聲波處理有助于種子中黃酮類物質的增加，但是功率過高則不利于黃酮類物質的積累.適宜功率的超聲波處理一定時間有助于種子中黃酮類物質的增加，但是隨著時間的延長，其黃酮類物質的含量增加不再顯著.超聲處理溫度升高有助于種子中黃酮類物質的增加，但溫度升高到一定程度時，其黃酮類物質的含量增加趨勢則變緩，若溫度過高則抑制了黃酮類物質的合成.溫度和功率均可影響植物萌發過程中SOD、過氧化物酶(Peroxidase,POD)和CAT活性相關酶的活性，從而影響其黃酮類物質含量[14].有研究表明，超聲波處理可促進小麥幼苗的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性提高而增加黃酮類物質的含量[15].

3 結論

研究不同超聲波功率、時間以及溫度處理對種子萌發的影響，并對最佳處理條件進行響應面優化.實驗結果表明，超聲波處理苦蕎麥種子的最佳工藝為超聲波功率320 W，超聲波時間30 min，超聲波溫度29 ℃，在此條件下苦蕎麥種子萌發率較高，達98%.培養4 d后的芽苗中黃酮含量較高，為8.24±0.32 g/100 g.超聲波處理有助于提高苦蕎麥種子的萌發，有利于萌發過程中黃酮類物質的富集.