GFP/Luc雙標食管癌細胞動物模型建立及其活體成像觀察

柏 文，彭曉清，王佩文，鞠前前，史 輝，蔣茂榮*

(南通大學 1.實驗動物中心； 2.醫學院； 3.附屬醫院心胸外科，江蘇 南通 226001)

中國是食管癌的高發地區，發病率位居世界第一。隨著以手術切除為主的系列治療的開展，食管癌的控制率有了顯著提高，但是食管癌的預后仍然很差。動物腫瘤模型是介于體外細胞實驗和臨床試驗之間的重要環節，彌補了實驗室與臨床的差距。其中，利用免疫缺陷動物建立皮下、原位和轉移腫瘤模型是闡明食管癌的分子機制以及抗癌藥物開發的重要工具。然而，傳統的動物實驗研究無法實時監測腫瘤的生長狀況和治療效果，特別是對于從外部看不到的腫瘤。

活體發光成像技術是非侵入性監測體內腫瘤生長的一種方法，實時連續動態監測體內的各種生物學過程，可以直接在活體動物體內觀察腫瘤的發生、發展和轉移等一系列生物學特性變化，以及抗腫瘤藥物在動物體內的分布、代謝及療效。主要采用生物發光和熒光發光兩種技術。生物發光是將編碼螢火蟲熒光素酶(luciferase，Luc)基因標記的腫瘤細胞移植到相應動物體內，并將酶底物注入動物體內。借助小動物活體成像系統，研究人員可以觀測活體動物體內腫瘤的生長及轉移等生物學過程[1]。由于硬件的進步，尤其是高靈敏冷卻CCD相機，可以靈敏地檢測活體腫瘤模型動物體內微小病灶的生物發光，保證動物的安全和測量結果的準確可靠，使得該技術成為臨床前腫瘤學研究極有價值的工具[2]。

本研究采用慢病毒轉染方法，構建了穩定表達綠色熒光蛋白(GFP)和Luc的人食管癌細胞系(ECA109-Luc-GFP)，并分析比較該細胞與正常ECA109細胞生物學特性的差異。通過小動物活體成像系統觀察了利用該細胞建立的食管癌動物模型的生長、轉移，為腫瘤動物模型的推廣應用和臨床食管癌防治研究提供了實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 人食管癌細胞系

人食管癌細胞系ECA109，購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 實驗動物

5周齡SPF級雄性BALB/c裸鼠10只，體重18～22 g，購自中國科學院上海實驗動物中心(SLACCAS)[SCXK (滬) 2017-0005]。實驗和飼養于南通大學實驗動物中心SPF屏障環境內[SYXK (蘇) 2017-0046]，實驗和飼養條件嚴格遵守標準化操作規程的規范要求(南通大學實驗動物使用與管理委員會批準號：20170303-004)。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.1.3 質粒構建、質粒提取和細胞轉染相關試劑

重組慢病毒載體pCDH-CMV-ffluc-EF1α-CopGFP由江蘇大學于峰惠贈。

1.2 主要試劑與儀器

RPMl-l640培養基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；DH5α感受態細胞、質粒提取試劑盒購自德國Qiagen公司；DNA電泳標記物(Marker)購自日本Takara公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；聚凝胺(polybrene)和MTT購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒和碘化丙啶(PI)均購自上海碧云天生物技術有限公司；D-熒光素(D-Luciferin)購自上海翊圣生物科技有限公司；復合麻醉劑(10 mg/kg甲苯噻嗪，95 mg/kg氯胺酮，0.7 mg/kg乙酰丙嗪)。小動物活體成像系統(IVIS Lumina XR Series III)購自美國珀金埃爾默(PerkinElmer)公司；酶標儀(ELX-800)購自美國Bio-Tek公司；倒置熒光顯微鏡(Eclipse TS100)購自日本尼康公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 GFP/Luc雙標的人食管癌ECA109細胞系(ECA109-Luc-GFP)的建立

載體構建和慢病毒包裝：重組慢病毒載體pCDH-CMV-ffluc-EF1α-CopGFP轉化DH5α感受態細胞，根據試劑盒說明書，提取重組DNA。將293T細胞提前一天接種于6孔板的培養孔中，將慢病毒載體pCDH-CMV-ffluc-EF1α-CopGFP、pMD2G和pSPAX2與Lipofectamine2000脂質體混合，室溫靜置20 min，加入培養基中，6 h后更換新鮮培養基，繼續培養。

慢病毒感染：轉染4 d后，收集細胞培養上清，并進行病毒滴度測定。將正常ECA109接種于6孔板中，第二天每孔加入6×106單位病毒顆粒。病毒感染后48 h，熒光倒置顯微鏡下直接觀察各孔中GFP的表達。

活體成像系統體外檢測Luc的表達：穩定轉染細胞(ECA109-Luc-GFP)培養至對數生長期，直接在熒光顯微鏡下進行觀察和檢測。同時胰酶消化計數，每孔2×104個ECA109-fluc-GFP細胞和正常ECA109細胞接種于96孔板，正常ECA109細胞作為對照，每孔加入終濃度150 μg/mL的熒光素酶底物(D-熒光素)，2～3 min后，置于活體成像系統內成像，檢測細胞在體外的Luc的表達情況。

1.3.2 ECA109-Luc-GFP和正常ECA109細胞生物學特性的比較

MTT分析法檢測兩種細胞活力的差異：每孔1×104個ECA109-Luc-GFP細胞和正常ECA109細胞接種于96孔板，置于5% CO2培養箱孵育48 h，棄上清液，每孔加入MTT(終濃度5 mg/mL)10 μL，置于5% CO2培養箱繼續孵育4 h后，每孔加入DMSO 100 μL。酶標儀(吸收波長570 nm)上檢測各孔OD值。實驗重復3次。

流式細胞儀分析法檢測兩種細胞增殖和凋亡的差異：每孔5×105個ECA109-Luc-GFP細胞和正常ECA109細胞接種于6孔板，置于5% CO2培養箱孵育48 h后。胰酶消化細胞，并用PBS洗兩遍，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室溫避光放置20 min，用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。同樣的方法，只用10 μL PI染色，進行細胞周期分析。

劃痕實驗檢測兩種細胞遷移能力的差異：每孔1×105個ECA109-Luc-GFP細胞和正常ECA109細胞接種于24孔板，置于5% CO2培養箱培養至融合度達90%，用100 μL移液器槍頭在培養孔中央劃一條直線，繼續培養48 h后，置于倒置顯微鏡下觀察拍照。實驗重復三次。

1.3.3 腫瘤模型的構建及活體成像觀察

食管癌皮下移植瘤構建和活體成像觀察：消化ECA109-Luc-GFP細胞，計數，用無菌PBS懸浮，制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×107/mL。每只裸鼠右側腋背部皮下接種0.2 mL細胞(約2×106)。待皮下移植瘤體積達到約100 mm3時，每只裸鼠經腹腔注射復合麻醉劑麻醉后，再按照150 mg/kg的D-熒光素/體重濃度進行腹腔注射。10 min后，放入活體成像儀暗箱內觀察。

食管癌轉移瘤構建和活體成像觀察：消化ECA109-Luc-GFP細胞，計數，用無菌PBS懸浮，制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×107/mL。每只裸鼠尾靜脈接種0.2 mL細胞(約2×106)。接種10 d后，每只裸鼠經腹腔注射復合麻醉劑麻醉后，再按照150 mg/kg的D-熒光素/體重濃度進行腹腔注射。10 min后，放入活體成像儀暗箱內觀察。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 GFP/Luc雙標的人食管癌ECA109細胞系(ECA109-Luc-GFP)的建立

利用編碼GFP和Luc慢病毒感染人食管癌細胞ECA109，來建立GFP/Luc雙標的ECA109細胞系(ECA109-Luc-GFP)。GFP/Luc雙標的ECA109-Luc-GFP細胞生長較快，倒置熒光顯微鏡下觀察可見細胞內綠色熒光信號較強，綠色熒光均勻分布于整個細胞內，GFP表達率高于90%，如圖1A所示。通過活體成像系統體外檢測ECA109-Luc-GFP細胞內Luc的表達，檢測結果顯示：ECA109-Luc-GFP細胞內可觀察到明顯的Luc表達，正常ECA109細胞內觀察不到Luc表達信號，具體如圖1B所示。

2.2 ECA109-Luc-GFP和正常ECA109細胞生物學特性的比較

首先通過MTT分析法比較ECA109-Luc-GFP和正常ECA109細胞活力的差異。統計結果顯示：與正常ECA109相比，ECA109-Luc-GFP細胞的細胞活力差異無顯著性(P>0.05)，結果見圖2A。其次通過流式細胞儀分析法比較兩種細胞細胞周期和凋亡的差異。細胞周期分析結果顯示：ECA109和ECA109-Luc-GFP細胞的G1期、S期和G2期所占比例分別約為39%、48%和13%，兩者相比差異無顯著性(P>0.05)，結果見圖2B。細胞凋亡分析結果顯示：兩種細胞的凋亡率均為4%左右，兩者相比差異無顯著性(P>0.05)，結果見圖2C。最后，通過劃痕實驗分析兩種遷移能力的差異。劃傷48 h后，分析結果顯示：兩種細胞的愈合率均為45%左右，兩者相比差異無顯著性(P>0.05)，結果見圖2D。以上分析結果均顯示，GFP/Luc雙標的ECA109-Luc-GFP細胞與正常ECA109細胞相比，細胞生物學特性無差異，說明GFP/Luc雙標沒有改變ECA109細胞的生物學特性。

注：A：倒置熒光顯微鏡下ECA109-Luc-GFP細胞觀察GFP的表達，標尺為400 μm。B：活體成像系統體外檢測ECA109-Luc-GFP細胞內Luc的表達。圖1 GFP/Luc雙標的人食管癌ECA109細胞系(ECA109-Luc-GFP)的建立Note. A: GFP expression in ECA109-Luc-GFP cells was observed under an inverted fluorescence microscope. Bar=400 μm. B: Luc expression in ECA109-Luc-GFP cells was observed by in vivo imaging.Figure 1 Establishment of a GFP/Luc double-labeled esophageal cancer cell line (ECA109-Luc-GFP)

注：A：MTT分析法比較ECA109-Luc-GFP和正常ECA109細胞活力的差異。B：流式細胞儀分析法比較ECA109-Luc-GFP和正常ECA109細胞周期的差異。C：流式細胞儀分析法比較ECA109-Luc-GFP和正常ECA109細胞凋亡的差異。D：劃痕實驗比較ECA109-Luc-GFP和正常ECA109細胞遷移能力的差異。標尺為400 μm。圖2 ECA109-Luc-GFP和正常ECA109細胞生物學特性的比較Note. A: MTT assay was used to analyze the difference in cell viability of ECA109-Luc-GFP and parental cells. B: Flow cytometry was used to analyze the difference in the cell cycle of ECA109-Luc-GFP and parental cells. C: Flow cytometry was used to analyze the difference in apoptosis of ECA109-Luc-GFP and parental cells. D: Wound healing assay was used to analyze ECA109-Luc-GFP and parental cells. Bar=400 μm.Figure 2 Comparison of the biological characteristics of ECA109-Luc-GFP and parental cells

2.3 腫瘤模型的構建及活體成像觀察

食管癌皮下移植瘤構建后活體成像觀察結果顯示：裸鼠皮下種植ECA109-Luc-GFP細胞后，當皮下移植瘤體積達到約100 mm3時，可以明顯地觀察到強烈熒光，而移植正常ECA109細胞的裸鼠未見熒光信號。具體見圖3A。食管癌轉移瘤構建后活體成像觀察結果顯示：裸鼠經尾靜脈注射ECA109-Luc-GFP細胞后10 d，可以觀察到小鼠肺部出現強烈熒光信號，而注射正常ECA109細胞的裸鼠未觀察到熒光信號，結果見圖3B。結果提示，食管癌細胞經尾靜脈注射后，主要轉移集中生長于小鼠肺部。

注：A：食管癌皮下移植瘤構建后活體成像觀察結果。B：食管癌轉移瘤構建后活體成像觀察結果。左側裸鼠為注射正常ECA109細胞，右側裸鼠為注射ECA109-Luc-GFP細胞。圖3 腫瘤模型的構建及活體成像觀察Note. A: Observation by in vivo imaging of esophageal cancer xenografts established by subcutaneous injection. B: Observation by in vivo imaging of esophageal cancer xenografts established by tail vein injection. The left nude mouse was injected with parental ECA109 cells. The right nude mouse was injected with ECA109-Luc-GFP cells.Figure 3 Cancer xenograft establishment and observation by in vivo imaging

3 討論

我們通過慢病毒轉導構建了穩定表達Luc和GFP的人食管癌ECA109細胞系，用于皮下腫瘤模型以及腫瘤轉移模型的構建。實際上，原位腫瘤模型與人類腫瘤微環境相近，與人類疾病進展密切相關，是最理想的動物模型。但由于小鼠食管的解剖位置以及建立原位模型的技術難度，往往難以實現[3]。綠色熒光蛋白基因(GFP)和熒光素酶基因(Luc)作為常用的報告基因(即其表達產物非常容易鑒定)，可在異源組織中表達并發光，是理想的標記物[4]。由于自身發光特性的缺陷，其應用往往具有一定的局限性。其中，GFP單標需要光的激發才能發出波長較長的可見光，并且由于生物體內發光的干擾，不能保證特異性，僅可用于淺表組織的檢測。同時，除了熒光素酶及其底物之外，還需要氧和ATP，因此僅能標記代謝活性腫瘤細胞。通過將GFP標記技術與Luc標記技術相結合，一定程度上彌補了其局限性。

在本研究中，我們用攜帶Luc-GFP的慢病毒感染人食管癌細胞，48 h后觀察GFP表達情況，GFP感染效率可達80%以上，我們挑選表達GFP的單克隆株進行培養增殖，并通過體外活體成像實驗檢測到生物發光信號，證明用慢病毒轉染方法，能夠構建穩定表達GFP和Luc的人食管癌細胞系(ECA109-Luc-GFP)。實驗所采取的ECA109-Luc-GFP細胞均為感染后傳5代以上的細胞，GFP/Luc雙標的ECA109-Luc-GFP細胞系非常穩定，并且顯微鏡下觀察傳代后2種發光信號的強度沒有發生變化。

本研究中，活體成像技術準確直觀的反映了腫瘤的生長和轉移，為腫瘤負荷的測量提供了快速而有效的方法。在體內食管癌模型研究中，活體成像與傳統方法相比具有明顯優勢，首先，作為一種非侵入性成像技術，活體成像技術可以采集同一動物的動態數據，減少了實驗動物數量。其次，三只甚至五只小鼠可以同時成像。但是在整個身體僅出現微弱熒光信號時，為了提高靈敏度，每次只能成像一個或兩個動物，并且將動物放置在靠近相機的位置[5]。第三，與其他檢測手段相比，提供了治療效果的相對評估，因為它僅代表代謝活性腫瘤細胞，而不是腫瘤體積[6]。第四，可以作為腫瘤細胞是否成功植入的指標，從而排除了可能由于異種移植不成功所導致藥物的不良反應。

活體成像技術為腫瘤的早期發展，治療反應，腫瘤復發，轉移性腫瘤和自發性腫瘤等動態生物學過程提供了一種良好的研究平臺，并且是監測體內抗腫瘤藥物治療效果的理想方法。活體成像技術應用潛力很大，本實驗中所提供的方法，有待進一步完善?；铙w成像技術僅在二維平面上以表面加權的方式收集腫瘤信號，這意味著靠近表面的較弱的光源與深層組織中較強的光源將具有相同的光強度[7]。因此，可以嘗試配合生物發光斷層掃描(BLT)，重建三維生物發光分布，監測腫瘤進展期間的立體形態和發光信號變化[8]。由于生物組織具有強散射和低吸收的特性，從而表現出各種光學行為，包括吸收、散射、反射和傳播等，導致圖像分辨率較低。通過改進現有的成像系統和降噪方法可以幫助獲得更高分辨率的圖像[9]。底物熒光素可通過腹腔、靜脈或皮下注射。每一種方法都有其優點和缺點，應針對不同情況，采用不同的注射方法[10]。靜脈注射可以使生物發光快速產生，因為底物能立即達到最大的血液濃度。然而，在處理動物時，靜脈注射在技術上具有一定難度。腹腔內注射操作簡單，在大多數腫瘤模型中，在5～10 min內可以獲得生物發光峰值。皮下注射也可用于全身傳遞，但生物發光緩慢。Genevois等人提出了iRFP/Luc雙標技術用于活體成像監測，同樣結合了兩種報告基因的優勢，擴大了活體成像的應用范圍[11]。

本文將GFP/Luc雙標技術與活體成像技術相結合，對食管癌裸鼠腫瘤模型進行活體的動態示蹤，清晰了解食管癌的生物學行為及特性，快速準確、簡便靈敏，為抗食管癌藥物研發、基因治療效果驗證提供了新思路。