五種革蘭陰性菌血流感染小鼠血清多肽譜的研究

麻雅婷，張可昕，楊明，陳琛，何賞，王成彬

血流感染是目前臨床上常見的感染性疾病之一，主要包括敗血癥和菌血癥。細菌性血流感染如果不能及時診治，可通過血液系統進行播散，隨之發展為系統性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，甚至膿毒癥，呈現一種廣泛且不受控制的炎癥反應，這是造成高病死率的主要原因[1-2]。近年來，由于抗生素、激素及免疫抑制劑的廣泛使用，創傷性診療技術的開展，血流感染的發病率呈逐年上升趨勢，給醫護人員及患者帶來了巨大的挑戰[3]。對于血流感染的診斷，血培養仍然是目前公認的金標準，但所需時間長、陽性率低，限制了其在早期診斷方面的應用，臨床亟需快速、準確的血流感染診斷技術。根據近幾年各醫院統計的血培養病原菌分布情況來看，革蘭陰性菌仍占主要地位，常見的臨床分離排名前5位的革蘭陰性菌分別為大腸埃希菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和變形桿菌(Proteus)[1,4-8]。本研究建立了上述5種細菌的血流感染小鼠模型，并應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)聯合磁珠提取多肽技術分析這5種革蘭陰性菌血流感染血清多肽圖譜的變化趨勢，以期為后續尋找診斷標志物并建立相關技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級ICR小鼠，體重25～27g，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司。小鼠飼養在ABSL2級動物室，在實驗前適應環境1周。

1.2 菌株來源 大腸埃希菌標準菌株ATCC25922、肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC1144、鮑曼不動桿菌標準菌株ATCC747、銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853和變形不動桿菌標準菌株ATCC29245均由解放軍總醫院微生物科惠贈。

1.3 儀器和試劑 MALDI-TOF MS質譜儀、弱陽離子交換磁珠及α-氰基-4羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)均購自北京毅新博創生物科技有限公司；BioexplorerTM軟件由北京Bioyong科技公司提供。三氟乙酸(TFA)、分析級乙腈購自北京化學試劑公司。實驗用水為Milli Q純水器制備的去離子水。

1.4 菌液的配制 對獲取的標準菌株進行平板分純及LB液體培養基增菌培養12h后，取100μl菌液于LB液體培養基中繼續增菌培養4～6h。大腸埃希菌的LD50濃度參考謝尹晶[9]實驗所得。其余菌株在進行液體培養基增菌后，將重懸的菌液配成4.0麥氏濁度，倍比稀釋為5個梯度濃度，經小鼠尾靜脈注射，每個濃度梯度注射5只小鼠，注射量為0.1ml/10g。連續觀察7d，每日觀察記錄小鼠精神狀態和死亡情況。采用Karber法計算各個細菌的LD50。通過前期實驗所得，肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和變形不動桿菌的LD50分別為1.1×109、9.6×108、1.5×108、8.1×108cfu/ml，在建立細菌性血流感染模型時均以1/2 LD50濃度菌液感染小鼠。

1.5 動物模型的建立及分組 小鼠隨機分為大腸埃希菌感染組、肺炎克雷伯菌感染組、鮑曼不動桿菌感染組、銅綠假單胞菌感染組、變形不動桿菌感染組和正常對照組。各感染組分別注射相應菌液，正常對照組注射無菌PBS，注射量均為0.1ml/10g。分別于感染后1、3、6、12、24、48、96、168h眼球取血，5000r/min離心20min，分裝其血清，–80℃儲存。各組每個時間段10只小鼠。

1.6 血清多肽的提取 具體操作步驟參考多肽提取試劑盒說明書。①渦旋混勻WCX 磁珠，將10μl磁珠、95μl磁珠結合緩沖液、10μl血清樣品混勻于0.2ml的PCR管中，室溫靜置5min后置于磁珠分離器內，靜置1min；②小心移去上清，加入100μl磁珠清洗緩沖液，充分混勻后將PCR 管置于磁珠分離器內，靜置1min，小心移去上清；③重復步驟“②”2次；④給移去上清含磁珠的管中加入10μl磁珠洗脫緩沖液，混勻后靜置1min，將管置于磁珠分離器內，靜置1min，使磁珠吸附至管壁，吸出含有多肽的洗脫液并轉移至新的0.2ml PCR管中，–20℃儲存。

1.7 MALDI-TOF MS質譜分析及數據處理 ①將1μl洗脫液點在ClinTOF-2靶板上，室溫干燥后將1μl基質(0.8% HCCA)覆蓋樣品上，室溫干燥；②將靶板放入MALDI-TOF質譜儀，設置激光頻率為20Hz，能量為75mv；③用標準品校正儀器后，檢測樣品，獲得由不同質荷比(mass charge ratio，m/z)的多肽峰構成的質譜圖。

1.8 統計學處理 所得多肽指紋圖譜采用BioexplorerTM軟件進行分析，并均經歸一化、基線校正和平滑處理。RB算法用以建立區分各感染組和正常對照組。采用秩和檢驗比較兩組峰值強度，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠感染后癥狀 小鼠在分別感染5種細菌6～12h后均出現精神萎靡，活動減少等；感染后小鼠體重減輕，證明小鼠細菌血流感染模型基本成功。

2.2 血清多肽質譜圖的檢測及對其差異多肽的分析 采用BioExplorer軟件分析各組血清多肽質譜圖，得到的峰列表和差異峰的數據見表1。5種革蘭陰性菌感染小鼠后，采用MALDI-TOF MS分析每種細菌的差異多肽峰，結果顯示，在這5種細菌感染組中共同出現的多肽峰有33個。表達趨勢為感染組高于正常對照組的多肽峰有4個，m/z分別為1001.7、1021.7、1230.2和1270.1；表達趨勢為感染組低于正常對照組的多肽峰有9個，m/z分別為1513.8、1533.3、2951.3、3113.3、3497.3、5007.3、7506.1、7516.2和7816.7(圖1)；其余多肽峰的變化趨勢不穩定。

表1 5種革蘭陰性菌血流感染小鼠血清多肽指紋圖譜差異峰比較(個)Tab.1 Difference peaks in serum polypeptide fingerprints of mice with bacterial bloodstream infection (n)

圖1 5種革蘭陰性菌血流感染小鼠血清多肽指紋圖譜的共有多肽峰Fig.1 Common peaks in serum polypeptide fingerprints of mice with bacterial bloodstream infection

2.3 細菌血流感染模型的建立 根據分析軟件內嵌的統計算法，發現KNN模型具有較高的分類效率，通過組合m/z7506.1、7516.2、7816.7、2951.3、5007.3這5個峰建立細菌血流感染診斷多肽指紋圖譜模型。該模型在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和變形桿菌血流感染診斷中的正確率分別為90.0%、86.7%、83.0%、85.0%和82.7%。

3 討 論

近年來，醫院分離得到的常見血培養細菌以革蘭陰性菌為主要部分，占50.0%～56.1%[1-3,8,10]；其中，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和變形桿菌是臨床血培養最常見的5種革蘭陰性菌。由于現階段激素的廣泛使用、內置靜脈導管的不合理處置，以及廣譜抗生素的濫用，血流感染的發病率呈逐年上升趨勢，給患者的診治及合理用藥帶來了巨大挑戰及高額花費[8,11-12]。臨床上對于血流感染的診斷主要依靠血培養，但其靈敏度受多方面因素的影響，如患者的身體狀況、抽血的時間及部位、血培養的類型及次數等，且耗時較長，假陽性率高，限制了該方法在早期診斷血流感染方面的效用。臨床現階段常用C反應蛋白、降鈣素原、白介素6等指標來輔助診斷，但其特異性低，在許多非感染的炎癥反應疾病中也有升高，使得輔助早期診斷血流感染的價值受到了限制。質譜是一種快速、敏感和高效的技術，現已廣泛應用于腫瘤、免疫性疾病及微生物菌種的鑒定等方面[13-16]，對于細菌性血流感染的血清學研究剛剛起步。筆者在前期相關研究[17]的基礎上，通過建立5種單細菌性血流感染模型，分析其差異多肽指紋圖譜，以此來輔助診斷血流感染。

通過分析比較5個細菌感染組和正常對照組的多肽指紋圖譜，共發現有33個共同出現的峰。提示在革蘭陰性菌造成的血流感染反應過程中，共同激發了相似的免疫反應。革蘭陰性菌致病物質主要為內毒素，為其細胞壁外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由特異性的O抗原、非特異性的核心多糖和脂質A三部分組成[4-5]。在細菌存活時，LPS僅為細胞壁的結構組成成分，通常不表現毒性作用；當細菌死亡裂解后，LPS游離出來，發揮毒性反應。其致病機制可能為LPS通過脂質A與血液中的LPS結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)結合后，再與單核-巨噬細胞表面的受體CD14分子結合，形成LPS-LBP-CD14復合物，并與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)及輔助受體髓樣分化因子2相互作用，觸發細胞內信號轉導級聯反應，激活單核-巨噬細胞產生和釋放腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8等細胞因子，繼而刺激免疫細胞、內皮細胞和黏膜上皮細胞等，產生一系列細胞因子、生物活性介質、急性期蛋白等，引起多種組織器官或全身性的病理生理反應，常見癥狀包括發熱、寒顫、精神萎靡等[18-19]。MALDI-TOF質譜檢測發現，在這些革蘭陰性菌引起的血流感染血清中有共同的多肽峰出現，從而印證了革蘭陰性菌所造成的免疫反應。一些常見的炎癥因子被發現，血清中紛繁復雜的物質中，一些小分子的多肽在今后輔助診斷血流感染方面仍然有巨大的價值。

除了5種細菌感染后血清中檢測到的共有特征峰外，每種細菌感染都有各自獨有的特征峰出現并表現出一定的趨勢。大腸埃希菌引起的血流感染血清多肽峰的變化趨勢，我們之前的研究已有闡述[17]。在肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和變形桿菌引起的血流感染中，同樣發現一些多肽峰隨著感染時間的不斷延長呈上升趨勢，分別為肺炎克雷伯菌感染中的m/z 1020.7、1203.9、1842.3；鮑曼不動桿菌感染中的m/z 1375.8、1436.3、1277.4；銅綠假單胞菌感染中的m/z 1152.5、1325.7；變形桿菌感染中的m/z 6978.9、6987.4。這些多肽峰的出現，提示機體為了應對感染可能產生一系列新的物質，其有望成為新的輔助診斷血流感染的標志物。還有一些多肽峰是隨著感染時間的不斷延長呈現先上升后下降的趨勢，分別為肺炎克雷伯菌感染中的m/z 1003.7、1916.9、3398.2；鮑曼不動桿菌感染中的m/z 1001.7、1172.8、6985.1；銅綠假單胞菌感染中的m/z 1047.6、1807.8、4083.3；變形桿菌感染中的m/z 1104.1、1151.3、1281.7、1322.5、1366.9，這些多肽峰在感染的早期呈現一個高水平的狀態，隨著感染的不斷進行，機體抗感染反應出現，使得這些高水平狀態的物質含量不斷下降，預示著這些多肽峰所對應的物質有可能成為早期升高的急性時相反應蛋白來輔助診斷血流感染。

MALDI-TOF MS技術作為蛋白組學研究的新技術，現已廣泛應用于肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、腎病等疾病[20-22]新型標志物的尋找中。在微生物研究方面主要應用于細菌、真菌等的鑒定中。由于微生物中應用質譜鑒定還需經過培養等環節，通過挑取單個菌落進行質譜分析，根據已有的數據庫進行比對得出菌種鑒定的結果，這其中就很大程度上依賴于數據庫的更新及操作的規范程度，由于很多菌種基因結構背景相近，質譜圖很難區分，所以給臨床微生物血流感染的診斷帶來了一定的不便[23-24]。目前，對于血流感染血清學多肽方面的研究還尚未見大量報道，而收集臨床血流感染標本時患者基礎疾病復雜，難以控制單一變量，故本研究通過建立ICR血流感染小鼠模型研究其血清學多肽的變化來尋找具有潛在臨床價值的生物標志物，用于輔助診斷血流感染，為臨床血流感染的防治提供良好的依據。

本研究重點分析了5種常見革蘭陰性菌血流感染的血清多肽指紋圖譜，發現了其共有的特征峰及每種細菌感染后的特征峰，由此建立相應的診斷模型，有望輔助早期診斷血流感染。今后我們還將建立常見革蘭陽性菌、真菌性血流感染等模型，分析革蘭陰性菌、革蘭陽性菌及真菌之間的血清差異多肽指紋圖譜，同時對尋找到的差異多肽峰進行二級質譜多肽鑒定，以期為血流感染新型標志物的尋找奠定基礎。