一例豬鏈球菌與藍耳病病毒混合感染的實驗室診斷

陶巍夫，李 超，王浩先，黃培鑫，倪宏波

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163000）

隨著我國養殖行業的快速發展，各種疾病給豬場的發展造成了嚴重的制約。同時人們對食品及生命安全提出了更高的要求，也為養殖行業敲響了警鐘，養殖場更應該注意養殖方式的合理化和規范化，給人們更多的保障。本文根據被送檢的病豬，運用臨床診斷、病理學剖檢、細菌學和PCR技術進行診斷，確診為鏈球菌和藍耳病病毒混合感染，現將診斷過程匯總如下。

1 材料與方法

1.1 病料的采集安達市某規模化養豬場送檢的患病仔豬，無菌條件下采集病死豬的肝臟、肺、脾臟、腎及小腸和淋巴結組織等病料進行后續診斷。

1.2 試驗材料Marker DL 2000購自大連寶生生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR Master Mix緩沖液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒購自MBI公司。其余試劑均為國產分析純。

1.3 引物設計根據GenBank中已發表的豬普通藍耳病（PRRS）和鏈球菌的基因序列及相關文設計特異引物。

表1 引物序列Table 1Peimer sequence

1.4 細菌分離培養無菌條件下采集仔豬肝、肺，在無菌臺中取肝、肺部病變組織，均勻涂在血液營養瓊脂培養基中，37℃下培養24 h后觀察培養基中菌落形態。將滅菌的載玻片取出，擦干，隨后滴加1滴生理鹽水，挑取單菌落并使其在生理鹽水中均勻分布，用酒精燈加熱玻璃片背面并余熱烘干，用革蘭氏染色液進行染色，油鏡觀察。從培養基中挑取單菌落涂在另一個血液營養瓊脂培養基中，37℃培養24 h后觀察培養基中菌落形態，查看污染情況。取2個試管分別加入5 mL LB液體培養基，用10培養槍頭從血液營養瓊脂培養基中挑取單個菌落加入其中一個試管中，另一個作為對照組，放在搖床中，37℃培養24 h后，觀察試管變化情況。

1.5 核酸的提取與 P C R鑒定

1.5.1 組織DNA和RNA提取按照TIANamp Geomic DNA Kit操作進行提取DNA；按照RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒進行RNA提取，-20℃保存備用。

1.5.2 RNA反轉錄和PCR擴增按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄盒說明書操作步驟將病毒提取的RNA進行反轉錄，得到的cDNA在-20℃進行保存備用。用得到的DNA和cDNA為模板，豬圓環病毒（PCV）、豬普通致病性豬藍耳病（PRRS）等特異性引物進行PCR反應擴增，取10 μL的擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 藥敏試驗將鑒定為豬普通致病性豬藍耳病和鏈球菌混合感染的純培養物用接種棒均勻涂布在鮮血培養基上，將藥敏紙片（慶大霉素、卡那霉素、恩諾沙星等10種藥物）分別貼于平皿中，37℃培養24 h，測定抑制菌圈直徑大小，根據檢測標準判定結果。

2 結果與分析

2.1 病理變化新生仔豬出現大量死亡，部分妊娠母豬出現部分流產，偶見木乃伊胎，感染后的母豬體溫上升，新生仔豬則出現呼吸困難、生長緩慢、日漸消瘦、站立不穩、耳廓呈現紫藍色出血斑點、皮膚蒼白并有小皰疹，病豬四肢呈現八字形外張、站立不穩等臨床癥狀。剖檢時主要的病理變化有脾腫大、彌漫性間質性肺炎。病豬剖檢可見腹腔積液、腸壁黏膜變薄出血、全身淋巴結腫大出血。病豬的皮膚多處出現紫紅色的出血斑點。

2.2 細菌分離結果將小塊肺臟組織均勻涂在血液營養瓊脂培養基中進行培養，培養出的菌落為連續鏈狀的菌落，挑取單菌落到血液營養瓊脂培養基中純化出單一菌落見圖3，革蘭氏染色后油鏡下觀察到革蘭氏陽性球菌，其形態見圖4。

圖1 肺臟纖維樣病變Fig.1Pulmonary fibrosis

圖2 脾臟出血、腫大Fig.2The spleen is bleeding and swollen

圖3 血液營養瓊脂培養基菌落形態Fig.3Blood nutrition AGAR medium colony morphology

圖4 革蘭氏染色鏡檢結果Fig.4Results of gram stain microsco py

2.3 P C R檢測結果

2.3.1 以細菌的DNA為模板，選用鏈球菌特異性引物進行PCR鑒定。PCR結果經瓊脂糖凝膠電泳分析見圖5，顯示第3泳道條帶為659 bp，與鏈球菌目的條帶大小相符。

圖5 細菌擴增結果Fig.5Bacterial amplification results

2.3.2 以患豬病毒的基因為模板，選用豬瘟病毒、圓環病毒以及藍耳病病毒的特異性引物進行PCR鑒定。結果藍耳病病毒為陽性，其余均為陰性。藍耳病病毒PCR結果經瓊脂糖凝膠電泳分析見圖6，第4泳道的條帶為373 bp，與藍耳病病毒的目的條帶相符。

圖6 病毒擴增結果Fig.6V irus amplification results

2.4 藥敏試驗結果

表2 藥敏試驗結果Table 2The results of drug susceptibility

3 討論

3.1 豬藍耳病，別名豬神秘病、豬不孕與呼吸綜合征、豬流產與呼吸綜合征、豬繁殖與呼吸障礙綜合征[1]。本病于1987年首次在美國的北卡羅來納州、明尼蘇達州、艾奧瓦州、印第安納州的豬群中暴發流行。1991年6月荷蘭學者首先從病料中分離出了病毒，并稱其為Lelystad毒株。1996年，我國郭寶清等首次從我國流產胎豬中分離出藍耳病病毒。由于該病原具有很強的致病性，藍耳病被列為二類動物疫病，2008年，高致病性藍耳病被我國農業部列為一類動物疫病。豬藍耳病病毒易變異，具有遺傳異質性，是全球豬健康和福祉最有負擔的病原體[2]。藍耳病不論什么品種、年齡、性別的豬，均可發病，其中妊娠母豬和1月齡內的仔豬尤為易感，本病呈地方流行性，無季節性[3]。豬藍耳病一般傳播方式為空氣傳播、性傳播、血液接觸以及垂直傳播[4]。該病還可與其他豬病混合或繼發感染發病。均為急性傳染病，臨床癥狀主要為新生仔豬大量死亡、體溫升高、食欲廢退、呼吸系統損傷。母豬妊娠后期發生流產、產木乃伊胎等病癥。同時還可能引發高致病性的藍耳病。高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒變異株引起的一種急性高致死性疫病，也是一種免疫抑制病［5］。高致病性藍耳病還有發病率極高、傳播迅速、發病急、發病時間長等特點。目前，針對此病尚無有效的治療藥物，通過免疫接種以及對癥治療等方法防控此類病癥，還可以通過使用抗生素減少繼發感染，以達到減少養殖行業的損失以及保障我們的人身安全。

3.2 豬鏈球菌病是由多種致病性鏈球菌混合感染引起的一種人畜共患病。早在1968的荷蘭和丹麥就有報道人感染豬鏈球菌的病例，目前全球已有400多余例人感染病例。我國在1998年的江蘇以及2005年的四川曾出現多例病例，嚴重的甚至導致死亡。現在每年還存在散發病例。鏈球菌的易感宿主較多，雞、兔、豬、馬、牛、羊等均為常見宿主。豬不論其品種、性別和年齡均可感染。鏈球菌病發病有時會呈現明顯的季節性，但臨床豬發病則不呈現明顯的季節性，在持續高溫時會出現大面積發病的情況。同時鏈球菌病的發病需要經諸多因素的誘導，其中不僅有環境因素、人為因素，還有遺傳因素。當飼養條件差或溫度忽高忽低時，動物免疫力下降就可能造成此病的爆發。該病可通過種群的直接或間接接觸發病，發病急，難以控制。其中，主要傳染源為患病和病死動物。鏈球菌病的臨床表現多樣，可表現為各種化膿創或敗血癥，也可表現為各種局部感染，同時伴有一些常見的臨床癥狀。如患有急性敗血癥的病豬會出現觸之尖叫、皮膚呈現藍紫色、流鼻液、便秘或倒地不起等癥狀。患有腦膜炎的病豬臨床癥狀有食欲減退、精神萎靡、出現轉圈運動、觸碰身體時發生抽搐、口吐白沫、四肢呈游泳狀滑動等。當患有亞急性或最急性型時會患關節炎、乳房炎等。患有關節炎的仔豬出現步態僵硬、肌肉震顫、四肢猛烈滑動死亡。淋巴結膿腫的豬則出現呼吸困難、體溫升高、頸部等處觸之堅硬、有熱痛等癥狀，并可能伴有神經癥狀。由于本病的發病特點，抗菌類的藥物可以有效地針對本類病進行治療，但是細菌的耐藥性不斷增強，為本病的治療增加了難度。鏈球菌病具有一定的傳染性，所以給現在的行業增添了風險，針對此病應該盡早發現，盡早確診，盡早治療，以降低養殖中的風險。

3.3 雖然至今還沒有治療豬繁殖與呼吸障礙綜合征的有效藥物，但是致病性豬藍耳病滅活疫苗已被研制出，且經過大量的試驗證明該疫苗安全有效，疫苗的防護效率可以達到80%左右[6]。為避免境外傳入，引進豬種時有關部門要嚴格進行檢疫，并進行隔離觀察，拒絕從發生過藍耳病的豬場購買豬種。如果發生高致病藍耳病，應立刻上報疫情，盡快封鎖豬場，對患病豬進行全面撲殺、銷毀，控制疾病的擴散和蔓延。嚴格執行全進全出、自繁自養的管理制度，對畜舍經常清掃消毒，保持通風，增加環境舒適度，并且要對飼養工具進行常態消毒處理。

3.4 目前，國內外已經研究出弱毒疫苗以及滅活疫苗。國內的變異毒株藍耳病疫苗包括JXA1-R、TJMF92和Hu-F112，經典的毒株主要有CH1-a和R98等，弱毒疫苗可產生體液免疫以及細胞免疫，效果明顯，能夠保證不出現嚴重臨診癥狀。對于健康的豬群應及時接種疫苗，提高抵抗力。目前市面的疫苗種類多樣，要根據區域流行毒株進行正確選擇[7]，由于藍耳病傳播迅速，流行范圍廣，并且該病的病毒抗原多樣，因此該病不能完全依賴疫苗注射。一般情況下對病畜進行緊急的疫苗接種是有效的，尤其是發病早期并準確診斷時，但不能長期依賴緊急的免疫措施，要做好綜合的防范措施和預防免疫。免疫是預防的關鍵，防止豬圓環病毒、豬瘟病毒、藍耳病病毒等病毒性疾病與巴氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌等細菌性疾病的混合感染[8]。

3.5 預防鏈球菌病的常規措施，包括平時對飼養環境的全面消毒、科學飼喂、建立良好舒適的飼養環境，并加以適當的運動。平時要注意牲畜全進全出、自繁自養的模式。提高動物的抗病能力，防止并發及繼發感染，可以有效地預防該病的傳播[9]。

3.6 在疾病流行的季節要提前做好免疫，制定健全的管理制度，科學執行，以免疾病爆發流行。預防鏈球菌病應采如下取措施。

3.6.1 做出正確診斷，制定相應的防護措施以及預防辦法，對病畜進行緊急隔離。禁止疫畜動物群體的活動，緊急上報相關的部門及臨近的縣、鄉。

3.6.2 對病豬所用的飼養工具進行全面的消毒處理，避免病毒的傳播，并將病畜的糞污進行合理處理等。

3.6.3 對豬圈要進行嚴格、徹底的清毒，這樣可控制傳染源，避免養殖場出現較大的疫情[10]。對全體動物進行全面的檢疫，如發現有臨床癥狀的病畜緊急進行隔離或淘汰。

4 結論

將被送檢的病豬，運用實驗室檢查、臨床診斷、病理學解剖、細菌學和PCR技術進行診斷，確診為豬鏈球菌和藍耳病病毒混合感染，確診之后對該疾病進行仔細分析，并給出了相應的治療方案以及預防措施。