天然止咳化痰乳劑對人工誘導兔子病理模型抗損傷的觀察

徐光科，左春生，吳海港

(信陽農林學院牧醫工程學院,河南 信陽 464000)

環境中有害氣體如氨氣進入呼吸道后被吸收，引起支氣管或細支氣管周圍細胞損傷，肺功能下降。此外，在有害氣體刺激下肺泡巨噬細胞和淋巴細胞增多，分泌腫瘤壞死因子-α、干擾素、IL-1等炎性介質，啟動早期炎癥反應并維持炎癥反應，對肺血管以及肺組織造成長期的慢性炎癥刺激[1-2]。炎癥反應的基礎是肺血管內皮細胞損傷。自然情況下，肺血管內皮細胞對肺毛細血管血管及肺組織起保護作用。氨氣長期刺激的情況下，肺血管內皮細胞受損，炎癥反應就會產生，嗜中性粒細胞是最早出現在炎癥部位的細胞。當肺組織受損時，肺組織中浸潤嗜中性粒細胞，它會釋放炎癥介質、蛋白酶、氧自由基[3]，進而再損傷肺組織

止咳化痰乳劑是一種純天然副作用小的中藥，主要成分包括紫蘇，陳皮和桉葉。紫蘇中含有多種植物多酚類物質和黃酮類物質。這些物質大多有酚羥基，而酚羥基能夠清除活性氧和自由基[4]。紫蘇中的植物多酚類具有較強的抗氧化能力，包括迷迭香酸、咖啡酸乙烯酯、咖啡酸烯萜酯等。紫蘇提取物中迷迭香酸具有清除羥自由基的作用[5]。此外，紫蘇提取物具有鎮咳作用，用紫蘇種子脂肪油以2.5 g/kg·bw劑量灌服小鼠，小鼠咳嗽次數明顯減少并且咳嗽間隔時間變長。

陳皮中的黃酮類化合物主要有黃酮、黃酮醇等，其以糖苷的形式存在于陳皮素、橙皮苷等物質中。川陳皮素能抑制自由基和羥自由基的產生，減少某些細胞中活性氧的產生，從而起抗氧化作用。試驗研究發現，陳皮水提液能抑制動物心、肝組織的脂質過氧化反應，還可以增強SOD酶活性[6-7]。

桉葉是常用的中草藥，有祛痰、抗菌、消炎鎮痛等作用。藥理試驗表明，桉葉油能促進唾液分泌，隨即激活吞咽反射，抑制隨即發生的咳嗽[8]，因而可作為氣體吸入劑用于呼吸道疾病的治療。鞣質、黃酮類和萜類是桉葉非油成分中主要的抗氧化物質。國外學者研究了19種桉屬植物并分離到9種活性物質，發現具有沒食子?；镊焚|和?；S酮醇類化合物抗氧化活性很強[9]。

本試驗率先使用氨氣刺激家兔初步探索構建肺損傷模型，并用止咳化痰乳劑治療并評估藥物抗病理損傷的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康家兔，雌雄各半，體重約2 kg，購自信陽職業技術學院實驗動物中心。

1.2 試劑與藥品 氨水、甲醛、二甲苯、無水乙醇，均購自上海國藥集團試劑公司；止咳化痰乳劑(信陽農林學院獸藥實驗室自制)。

1.3 儀器 BS-490生化分析儀，BC-2800 Ve.t.獸用血細胞分析儀，邁瑞生物醫療電子股份有限公司；QPJ-1B病理石蠟切片機，上海斯歐醫療器械有限公司；NE-C25S霧化器，歐姆龍(大連)有限公司；BW GAXT-A 氨氣檢測儀，加拿大BW科技有限公司。

1.4 方法 自制3個容器，分別標記為甲箱、乙箱、丙箱。本試驗采用一個長150 cm，寬100 cm，高80 cm的塑料密閉容器，上邊側面開數個小孔以保證箱內為常壓狀態及箱內外溫濕度一致。

將健康家兔，隨機分為A、B、C 3組，每組5只，A組為正常對照組，B組為模型組，C組為治療組。A組放入甲箱，不用氨氣刺激，連續飼養10 d。B組放入乙箱用7.8%氨水噴霧刺激，1次2 h，1日2次，兩次刺激間隔3 h，連續刺激9 d，建立肺損傷模型。C組放入丙箱用相同濃度氨水刺激相同時間，每次開始試驗前1 h以0.5 mL/只的劑量灌服止咳化痰藥，其余條件3組都一樣。(箱內氨氣濃度用氨氣測定儀測定濃度為：97 mg/m3)

整個試驗過程中兔子自由呼吸，自由采食，自由飲水，無窒息現象。在氨氣刺激期及正常飼養時觀察兔子活動行為與精神狀態等一般形態，同時監測兔子的體溫以及刺激前后呼吸頻率變化的平均值。

在試驗期間采全血進行生化指標檢測和血常規檢測以摸索建立肺損傷模型合適的條件。氨氣刺激結束后，將A、B、C 3組家兔致死，手術切除全肺，0.9%生理鹽水清洗表面血污等，然后用10%福爾馬林溶液固定24 h，制作病理切片H.E.染色。

2 結果

2.1 對家兔一般行為及呼吸的影響 在刺激10 min左右，兔子出現特別煩躁不安的現象，之后慢慢轉為安靜狀態；整個過程中，兔子有眨眼甚至閉眼、流眼淚、扒鼻，并伴有噴嚏、間歇性咳嗽現象；刺激結束后，動物飲水、飲食并無明顯改變，5 min后精神狀態恢復原狀。試驗整個過程中家兔體溫正常，A組呼吸頻率36-45 times/min；B組呼吸頻率48-67 times/min；C組呼吸頻率42-55 times/min

2.2 血液生理指標試驗結果 家兔血液生理指標試驗結果見表1，從表中可以看出模型組兔子白細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞隨著氨氣刺激時間的增加，呈增高趨勢，比對照組分別提高58.7%、71.7%、50.1%、 116.7%，差異顯著(P<0.05)；而治療組和模型組相比，白細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞數量顯著下降，分別降低31.%、36.7%、50.1%、29.2%，差異顯著(P<0.05)提示止咳化痰乳劑可以降低肺臟炎癥反應；治療組和對照組相比白細胞、淋巴細胞、單核細胞變化不大，差異不顯著。嗜中性粒細胞差異顯著；試驗各組紅細胞、血小板、血紅蛋白差異不顯著。

表1 各組家兔血液生理指標檢測結果

注：同行不同字母表示差異顯著(P﹤0.05)，相同字母表示差異不顯著(P﹥0.05)，下表同

2.3 血液生化指標檢測結果 家兔血液生化指標檢測結果見表2。對照組相比，模型組中家兔的ALT、BUN、 血氨分別提高106.5%、91.6%、320%，差異顯著(P<0.05)。提示：經藥物治療后，治療組中ALT、BUN、 血氨較模型組分別降低：34.7%、17.39%、31.3%，差異顯著，提示止咳化痰乳劑可以減少氨氣對肝臟和腎臟的功能損傷。試驗各組ALKP、 CREA、GLU、TP 變化不大。差異不顯著。

表2 各組家兔血液生化指標檢測結果

2.4 病理學診斷結果 正常組家兔肺泡結構完整清晰，肺泡隔無腫脹，腔內無滲出物。與治療組(見中插彩版圖1)對比，模型組(見中插彩版圖2)明顯可見肺間質充血、出血，腔內有紅細胞滲出，肺間質大量炎癥細胞浸潤，肺泡大小不一，部分肺泡腔變小且肺泡壁變厚甚至實變。治療組雖有炎癥細胞增生，但不明顯，肺泡腔內無滲出物。肺泡壁雖有增厚，但基本結構完整，從整體上看治療組的肺損傷有明顯好轉。

3 討論

畜舍內，家畜排泄物和飼料等有機物的分解，可產生許多化學物質。其中會出現許多有害成分，危害最大的主要有：氨、硫化氫等。在畜舍內，氨大多由含氮有機物(糞、尿、飼料和墊草等)分解而來。畜舍空氣中一定濃度的氨將影響動物的呼吸道疾病，當空氣中氨的濃度達到50～75 mg/m3，對仔豬抗肺部疾病能力產生不良影響。本試驗采用氨氣刺激法構建肺損傷模型，初步探索得出97 mg/m3的氨氣濃度可用于構建肺損傷模型。

氨氣刺激前后兔子呼吸加快可能的原因為：家兔吸入氨氣，氨氣可能刺激呼吸道黏膜細胞并且損傷肺血管內皮細胞[10]，引起炎癥反應，在炎性介質的參與下，肺微毛細血管損傷進而導致肺水腫。同時，氨氣吸入的早期，家兔體內氧自由基增多，氧自由基會對肺細胞生物膜和肺間質造成破壞，影響肺微血管的結構和功能，降低肺的抗炎和抗氧化能力，對肺組織造成損傷使呼吸功能出現障礙。

生化指標檢測結果顯示，模型組比治療組的ALT升高較多，提示氨氣可能對肝細胞造成損傷；BUN升高和CREA處于正常波動范圍，可能氨氣的吸入對腎臟損傷不及肝臟敏感；進入肺泡的氨，大部分被吸收至血液，結果顯示，血氨持續升高，提示肝細胞可能受損。若加大氨水濃度或增加刺激時間，肝臟可能出現代謝異常甚至出現嚴重病變；經藥物治療后，治療組中ALT、BUN、 血氨較模型組分別降低：34.7%、17.39%、31.3%，提示止咳化痰乳劑可以減少氨氣對肝臟和腎臟的功能損傷。

肺組織病理學診斷結果為，正常組的兔子未見病理損傷，肺泡結構完整。模型組的兔子明顯可見肺間質有大量紅細胞、炎癥細胞浸潤，肺泡腔大小不一，腔內有少量紅細胞滲出，部分肺泡腔變小且肺泡壁變厚甚至實變。血常規檢測顯示，模型組兔子氨氣刺激后白細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞呈增高趨勢，比對照組分別提高58.7%、71.7%、50.1%、 116.7%，結合病理切片觀測提示，肺經過氨氣刺激后炎癥損傷比較明顯。

治療組顯示，炎癥明顯好轉，肺間質有少量的炎癥細胞浸潤，出血不明顯，肺泡腔內無滲出物，肺泡隔結構較完整。血常規檢測顯示，而治療組和模型組相比，白細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞數量顯著下降，分別降低31.%、36.7%、50.1%、29.2%。說明紫蘇、陳皮、桉葉等中藥對抑制炎性細胞的浸潤，清除體內氧自由基以及對氨氣引起的肺部炎癥損傷有保護作用。

本試驗所用止咳化痰乳劑富含桉葉素、α-蒎烯、紫蘇醛，其機理可能是：紫蘇乙醇提取物可通過調節 Src-家族 酪氨酸激酶信號傳導通路并減少 Ca升動員，調節 N-甲酰L-甲硫氨酰L-白氨酰-L苯丙氨酸刺激的嗜中性粒細胞的激活[11]；降低慢性支 氣管炎大鼠的內皮素-1、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，提高超氧化物歧化酶 (Superoxidedismutase，SOD)活性和 NO含量，清除機體自由基，提高機體抗氧化損傷能力，減輕氣道炎癥反應[12,13]；桉葉素、α-蒎烯可能通過抑制TLR4/MyD88通路及NLRP3炎癥小體活化減少IL-1β表達并抑制Th免疫反應從而減輕了氨氣所致的急性肺炎[14]。

綜上所述，天然獸用止咳化痰乳劑對肺損傷有保護作用，為減少抗生素的使用及推廣天然止咳化痰乳劑提供理論依據，同時也為治療呼吸系統疾病提供了新途徑。