干擾素調(diào)節(jié)因子8在慢性阻塞性肺病中作用及其機(jī)制

周淼 焦莉 孫俊波

1河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心（鄭州 450046）；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院肺病科（鄭州 450008）；3河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）內(nèi)科（鄭州 450002）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種由多種原因引起的慢性氣道炎性疾病。COPD主要特征為不完全可逆的持續(xù)氣流受限。形成氣流受限的原因在于氣道重塑和肺泡破壞，與氣道上皮炎性侵潤和連續(xù)的組織破壞有密切關(guān)系［1］。

干擾素調(diào)節(jié)因子8（interferon regulatory factor 8，IRF-8）是一種核轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)干擾素的表達(dá)。IRF-8參與多種病理生理過程，如宿主免疫、細(xì)胞生長、分化和腫瘤發(fā)生［2］。IRF8能夠顯著促進(jìn)炎癥因子的分泌［3］。LANGLAIS 等［4］表明巨噬細(xì)胞中IRF-8是防止感染所必需的，并且與慢性炎癥有關(guān)。然而，對于IRF-8在COPD中的作用卻未見相關(guān)報道。

microRNA作為COPD的治療靶點受到越來越多的關(guān)注。miRNA微陣列分析結(jié)果表明miR-218在COPD患者肺組織中明顯降低，其表達(dá)與氣道阻塞顯著相關(guān)［5］。SCHEMBRI等［6］表明與不吸煙者相比，miR-218在吸煙者人支氣管上皮細(xì)胞（human bronchial epithelial cells，HBEC）中顯著下降。上述研究提示miR-218可能在COPD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

因此，本文通過敲除IRF-8，探究IRF8對HBEC炎癥和增殖的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制以期為COPD的治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2016年10月到2017年3月，收集河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院肺病科住院的21例COPD患者。其中女9例，男14例，年齡45～67歲，所有患者均符合2013年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。對照組為同期在本院呼吸科的12例健康體檢者，其中女5例，男7例。所有患者在治療前2周均未使用糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑，入選患者排除支氣管哮喘、肺間質(zhì)纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病及合并有嚴(yán)重肝腎疾病、腫瘤及血液系統(tǒng)疾病。兩組患者在年齡，性別比例上無顯著差異。

1.2 實驗材料Trizol試劑和Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；BEGM培養(yǎng)基（德國Promocell）；IRF8-NC及IRF8-siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；PrimeScript RT reagent kit，SYBR Green mix（大連寶生物工程公司）；PVDF膜（Millipore，USA）；抗人IRF8抗體、p65和p-p65抗體（Santa Cruz公司）；MTT試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 誘導(dǎo)痰的制備誘導(dǎo)前測定FEV1值并吸入200 μg沙丁胺醇，然后用3%的無菌高滲鹽水為患者進(jìn)行霧化10～20 min，收集痰液于無菌干燥痰杯中。隨后用鑷子取出痰液黏稠、密度大的部分，稱重后，加入痰液重量4倍體積的0.1%二硫蘇糖醇（DTT）；反復(fù)吹打數(shù)次后，置于37℃震蕩30 min。用48 μmol/L尼龍網(wǎng)過濾。4℃，1 200 r/min離心10 min后吸取痰上清，并于-80℃凍存待用。

1.3.2 HBEC的采集及培養(yǎng)選擇受試者2～3級支氣管進(jìn)行刷檢，并收集細(xì)胞于預(yù)冷的BEGM完全培養(yǎng)液中。經(jīng)100目和200目篩網(wǎng)過濾以去除黏液，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清后用BEGM完全培養(yǎng)基配制成細(xì)胞懸液。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實驗分組取對數(shù)生長期的HBE細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板（2×105/孔），待細(xì)胞融合至80%，按照Lipofectamine 2000試劑說明書轉(zhuǎn)染IRF8-siRNA或其對照（IRF8-NC），48 h后檢測細(xì)胞中IRF8的表達(dá)水平以驗證轉(zhuǎn)染效果。實驗分為4組：Control組（健康對照者HBEC），COPD組（COPD患者HBEC），NC組（COPD患者HBEC轉(zhuǎn)染IRF8-NC），IRF8-siRNA組（COPD患者HBEC轉(zhuǎn)染IRF8-siRNA）。

1.3.4 實時定量PCR用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA。隨后按照PrimeScript RT reagent kit說明書合成cDNA。采用SYBR Green mix于ABI 7500進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。

1.3.5 Western blot收集細(xì)胞裂解液并測定蛋白濃度。選取20 μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。隨后將膜分別與IRF8、p65、p-p65及GAPDH抗體4℃孵育過夜，隨后加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體繼續(xù)室溫孵育1 h。用ECL發(fā)光系統(tǒng)檢測目的條帶。用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測TNF-α、IL-6及IL-8的濃度收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后收取上清液，按1∶100稀釋后加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中，37℃孵育1 h。洗滌后每孔加入100 μL酶標(biāo)抗體，再次37℃孵育1 h，每孔加入100 μL TMB-過氧化氫尿素溶液，37℃下避光放置5 min，加入50 μL終止液，測定各孔在450 nm處的吸光值。

1.3.7 細(xì)胞增值實驗將細(xì)胞接種于96孔板（5×104個/孔），然后向每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）和200 μL二甲基亞砜。酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光值。

1.3.8 熒光素酶報告實驗構(gòu)建IRF8-3′UTR報告基因質(zhì)粒，并將其與miR-218 mimic或miR-218 control共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，采用熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0分析，計量資料用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IRF8表達(dá)水平及其與氣流受限相關(guān)性分析健康對照者與COPD患者誘導(dǎo)痰上清液中IRF8水平分別為（5.87±0.93）ng/mL、（6.73±1.05）ng/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與健康對照者相比，COPD患者HBEC中IRF-8的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05；圖1A）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HBEC中IRF8表達(dá)量與FEV1占預(yù)計值的百分比（FEV1%）呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.73，P＜0.001；圖1B）。

圖1 IRF-8表達(dá)水平及其與FEV1%相關(guān)性分析Fig.1 The expression of IRF-8 and its correlation with FEV1%

2.2 IRF8的低表達(dá)顯著降低了HBEC中炎癥因子的水平siRNA轉(zhuǎn)染后，IRF8-siRNA組中IRF8的mRNA及蛋白水平顯著降低（P＜0.01）（圖2）。ELISA實驗表明與健康對照者相比，COPD患者誘導(dǎo)痰上清液及HBEC中TNF-α、IL-6和IL-8水平明顯升高（表1和圖3）。IRF8低表達(dá)可降低TNF-α、IL-6和IL-8的水平（圖3）。

表1 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測受試者誘導(dǎo)痰上清液TNF-α、IL-6和IL-8水平Tab.1 The level of IL-6，IL-8 and TNF-α in the supernatant of medium analyzed by ELISA ±s

表1 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測受試者誘導(dǎo)痰上清液TNF-α、IL-6和IL-8水平Tab.1 The level of IL-6，IL-8 and TNF-α in the supernatant of medium analyzed by ELISA ±s

注：與健康對照組比較，aP＜0.05

組別健康對照組COPD組TNF-α（pg/mL）87.5±51.3 165.7±68.1a IL-6（pg/mL）70.6±19.8 158.3±60.7a IL-8（ng/mL）2.1±0.7 11.5±3.6a

2.3 IRF8低表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響如圖4所示，與Control組相比，COPD患者HBEC細(xì)胞增殖能力明顯增加。IRF8低表達(dá)可降低細(xì)胞的增殖能力。

2.4 IRF8的低表達(dá)激活了NF-KB信號通路與Control組相比，COPD組p-p65表達(dá)水平顯著升高。而IRF8的低表達(dá)顯著抑制了p-p65的蛋白表達(dá)水平（P＜0.05，圖5）。

圖2 各組IRF8表達(dá)水平Fig.2 The expression of IRF8 in each group

圖3 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測各組IL-6、IL-8和TNF-α水平Fig.3 The level of IL-6，IL-8 and TNF-α in each group detected by ELISA

2.5 miR-218靶向作用于IRF8生物信息學(xué)工具microRNA.org和Targetscan預(yù)測顯示miR-218可能靶向作用于IRF8。RT-qPCR結(jié)果顯示COPD患者HBEC中miR-218水平顯著高于健康對照者組（圖6A）。熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)miR-218 mimic可顯著降低野生型熒光素酶報告基因的熒光強(qiáng)度（P＜0.01；圖6B），但對突變型熒光素酶報告基因的熒光強(qiáng)度無影響（P＞0.05；圖6B）。過表達(dá)miR-218也可顯著抑制IRF8的mRNA及蛋白水平（圖6C-D）。

圖4 MTT實驗檢測各組細(xì)胞增殖能力Fig.4 The cell viability was detected by MTT assay

3 討論

圖5 各組p65表達(dá)水平Fig.5 The expression of P65 in each group

圖6 miR-218靶向調(diào)節(jié)IRF8Fig.6 miR-218 targeted regulation of IRF8

氣道重塑和肺泡破壞是氣流受限的主要原因。氣道上皮細(xì)胞作為與環(huán)境的重要接口，其損傷是導(dǎo)致氣道重塑的典型病理特征［8］。本研究發(fā)現(xiàn)IRF8在COPD患者誘導(dǎo)痰及HBEC中顯著升高，并與FEV1%呈負(fù)相關(guān)性。IRF8可通過激活NF-κB通路從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，提高HBEC增殖能力。另一方面，miR-218可靶向作用于IRF8。

IRF8屬于干擾素調(diào)節(jié)因子家族一員，在干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮著重要的作用［9］。當(dāng)暴露于脂多糖和外在微生物產(chǎn)物時，IRF8可激活或抑制病原體應(yīng)答轉(zhuǎn)錄程序［9］。另一方面，干擾素調(diào)節(jié)因子家族的其他成員與COPD的發(fā)生有關(guān)。IRF7在鼻病毒感染的COPD培養(yǎng)物中顯著增加［10］。IRF3蛋白在感染合胞病毒的A549細(xì)胞中增加［11］。COPD作為一種慢性氣道炎性疾病，其發(fā)生發(fā)展過程是否與IRF8有關(guān)尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，IRF8在COPD患者誘導(dǎo)痰及HBEC中顯著升高。這一結(jié)果與GRIET等［5］的發(fā)現(xiàn)一致。之前研究發(fā)現(xiàn)IRF8在多種炎性疾病異常表達(dá)并參與疾病的病理過程［3，12］，提示 IRF8 在炎性疾病中的重要作用。本文研究發(fā)現(xiàn)低表達(dá)IRF8能夠有效地抑制COPD細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。ISHII等［13］發(fā)現(xiàn)IRF3-/-小鼠肺部炎性介質(zhì)下調(diào)，肺氣腫形成受到抑制。IRF8在動物體內(nèi)是否有相同的作用還有待研究。

NF-κB通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞粘附分子的表達(dá)而在氣道病理學(xué)中起重要的作用。長期香煙煙霧或脂多糖刺激可增加IKK α/β的磷酸化及NF-κB的激活，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)在COPD患者誘導(dǎo)痰及HBEC中p65的磷酸化水平升高，與DI等［15］的研究結(jié)果相似。抑制IRF8的表達(dá)可顯著降低p65的磷酸化水平。研究表明IRF8基因敲除小鼠由于缺乏與IL-12 p40啟動子（含CACCC位點）的結(jié)合，IL-12 P40表達(dá)下調(diào)［12，16］。而 p40啟動子上含有 NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點［17］，因而筆者推測抑制IRF8可能是通過下調(diào)IL-12 p40而導(dǎo)致p65磷酸化水平降低。上述結(jié)果提示IRF8是通過NF-κB通路調(diào)控炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與COPD的進(jìn)程。

綜上所述，本文研究揭示了IRF8作為炎癥反應(yīng)的重要參與者在COPD治療中的重要作用。IRF8的抑制可為COPD的治療提供新的思路和理論依據(jù)。COPD是一個多因素作用的結(jié)果，因而動物水平IRF8在COPD發(fā)生中的作用有待進(jìn)一步研究。