結直腸癌中MACC1的表達及與淋巴結轉移的相關性

邱麗湞 吳共發(fā) 劉鈺君 黃綺亭 曾宇婷 李海剛，3

廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院1體檢中心，2病理科（廣州 511300）；3中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院病理科（廣州510120）

結直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，截止2014年CRC的發(fā)病率居我國惡性腫瘤的第3位，病死率位居全國惡性腫瘤的第4位［1-2］。目前，對CRC的治療以外科手術為主，采用放化療以及靶向治療等綜合治療方法，然而CRC根治術的5年生存率僅約50%，侵襲和轉移仍然是導致患者死亡的主要原因［3］，所以，闡明CRC侵襲和轉移的具體機制，尋找特異有效的治療靶點，具有重要意義，但CRC的侵襲和轉移是牽涉到多步驟、多階段和多基因的復雜生物學過程，至今所涉及的分子機制尚未闡明。結腸癌轉移相關基因-1（metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1）是2009年被證實的一個與結腸癌轉移密切相關的基因［4］，有望為CRC分子靶向治療提供新的策略［5］。目前國內外針對MACC1在CRC中的相關研究均有報道，但MACC1在CRC發(fā)生、發(fā)展以及作為治療靶點的相關機制尚未完全闡明。本研究在組織學和細胞學水平層面，以有無淋巴結轉移為切入點，采用免疫組化和免疫細胞化學方法檢測CRC組織和不同轉移潛能的CRC細胞系中的MACC1表達，探討CRC中MACC1表達與淋巴結轉移的關系，為后續(xù)進一步研究MACC1在CRC侵襲和轉移中的作用以及是否能作為治療靶點提供初步理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料選取廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院病理科庫存的2015年3月至2017年12月手術切除的77例大腸癌及癌旁石蠟組織，均經過4%中性緩沖甲醛固定及石蠟包埋。所有病例均有完整的臨床資料并且經過病理診斷證實。結直腸癌的病理診斷根據WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類標準第四版，臨床分期參照美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）第七版分期。所有病例術前未經放化療。人結直腸癌細胞系SW480和SW620由南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系提供。兔多克隆濃縮型抗體MACC1（產品編號ab106579）購自英國abcam公司。即用快捷型免疫組織化學 MaxVisionTMHRP（Mouse/Rabbit）檢測試劑盒（產品編號KIT-5002）、PBS緩沖液、DAB顯色劑、檸檬酸鹽抗原修復液和抗體稀釋液均購自福州邁新公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學檢測所有石蠟組織塊4 μm厚切片，防脫玻片撈片后于70℃烤箱烤片30 min，常規(guī)脫蠟至水后玻片放入高壓鍋內，加入足量檸檬酸鹽修復液至完全浸沒玻片，電磁爐加熱沸騰高壓修復3 min，自然冷卻后PBS漂洗5次，每3 min一次，玻片浸泡在醫(yī)用雙氧水中10 min，PBS漂洗5次，每3 min一次；加入抗MACC1一抗（稀釋度1∶1 500），37℃孵育1 h，PBS漂洗5次，每3 min一次，加入二抗，37℃孵育20 min，PBS漂洗5次，每3 min一次；DAB顯色，顯微鏡下控色，自來水終止DAB顯色，蘇木素復染細胞核，70℃烤片30 min至完全烤干水分后中性樹脂封固。以人肝組織為陽性對照，PBS取代一抗作陰性對照。

1.2.2免疫組織化學結果判定MACC1陽性顯色主要定位于細胞漿，少數可同時定位于細胞核。陽性顯色為細胞中的相應部位出現棕黃至棕褐色顆粒著色。染色結果判定參照文獻［6］，由高年資病理醫(yī)師在雙盲情況下對切片染色結果進行判讀：按染色強度計分，無色計0分，淡黃色、棕黃色和棕褐色依次1、2、3分；再將陽性細胞數所占百分比打分：陰性判為0分，陽性細胞數百分比在≤10%、11%～50%、51%～75%和＞75%分別計1分、2分、3分和4分，染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞3分判為免疫組化結果陽性。

1.2.3免疫細胞化學染色SW480和SW620細胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱。取6個不同培養(yǎng)批次的生長狀態(tài)良好的細胞，胰酶消化后低速離心收集，制作石蠟包埋細胞塊，細胞塊制作方法按照文獻［7］。石蠟細胞塊4 μm厚切片，免疫細胞化學檢測檢測操作方法同上述免疫組織化學檢測。以棕黃色為陽性信號，按照染色深淺，分為弱陽性（1+），中等陽性（2+），強陽性（3+）。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料組間率的比較采用Pearson Chi-Square Test，結直腸癌淋巴結轉移的多因素分析采用二分類的Logistic回歸分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MACC1在CRC組織中的表達MACC1蛋白陽性表達于CRC組織的細胞漿，部分癌細胞的細胞核也有表達，癌組織周圍的纖維間質也可見陽性表達（圖1），MACC1蛋白在CRC組織的陽性表達率76.62%（59/77）。MACC1蛋白在癌旁正常黏膜組織中大部分呈陰性表達，陽性表達率11.69%（9/77）。統(tǒng)計顯示MACC1在CRC組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常黏膜（χ2=65.83，P=0.00）。

圖1 免疫組化檢測MACC1在結直腸癌中的表達（MaxVisionTM×200）Fig.1 Immunohistochemical detection of MACC1 expression in colorectal carcinnoma

2.2MACC1與結直腸癌淋巴結轉移的單因素分析經單因素分析可知，腫瘤分化程度、腫瘤大小、浸潤深度、MACC1陽性表達、神經侵犯和臨床分期可能是CRC淋巴結轉移的高危因素（均P＜0.05），年齡、性別不是淋巴結轉移的高危因素（均P＞0.05）。見表1。

2.3影響結直腸癌淋巴結轉移的多因素Logistic回歸分析對可能是影響結直腸癌淋巴結轉移的6個高危因素進行Logistic回歸分析，結果顯示MACC1異常高表達、神經侵犯、浸潤深度和臨床分期是結直腸癌淋巴結轉移的獨立危險因素（均P＜ 0.05），見表2。

表1 結直腸癌與淋巴結轉移的單因素分析Tab.1 The univriate analysis of lymph node metastasis in colorectal carcinoma例

表2 影響結直腸癌淋巴結轉移的多因素Logistic回歸分析Tab.2 The multivariate binary logistic regression analysis of lymph node metastasis in colorectal carcinoma

2.4不同轉移潛能CRC細胞中MACC1表達情況MACC1蛋白在SW480細胞中呈弱或中等陽性表達（1+或2+），在SW620細胞呈中等陽性或強陽性表達（2+或3+）（圖2）。統(tǒng)計分析顯示，MACC1蛋白在SW620細胞中的表達明顯強于SW480細胞（χ2=20.11，P=0.00，表3）。

圖2 免疫細胞化學檢測MACC1在SW480（A）和SW620（B）細胞中的表達（MaxVisionTM×200）Fig.2 Immunocytochemical detection of MACC1 expression in SW480（A）and SW620（B）cells

表3 MACC1在SW480和SW620細胞中的表達比較Tab.3 Comparision of MACC1 expression in SW480 and SW620 cells例

3 討論

CRC的多學科綜合治療已迅速發(fā)展，但中晚期CRC的臨床治療效果有限，5年生存率仍然不高。國內外眾多研究表明，侵襲和轉移是至關重要的因素。因此，針對CRC侵襲和轉移的策略成為研究的熱點。MACC1蛋白定位于人類的7號常染色體上（7P21.1），具有廣泛的生物學功能，特別是在調控惡性腫瘤的侵襲和轉移等方面具有不可代替的重要功能［8］。已證實MACCl編碼的蛋白質能通過調節(jié)激活肝細胞生長因子/肝細胞生長因子受體（HGF/c-Met）通路中的c-Met基因，上調c-Met蛋白的表達，促進腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉移［9］。MACCl在多種惡性腫瘤如結腸癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌等組織中表達異常增高，與腫瘤臨床分期、有無遠處轉移密切相關，有作為腫瘤轉移和預后判斷的潛在獨立指標，有望為惡性腫瘤的基因治療提供新靶點［10-11］。

本研究結果顯示MACC1在CRC組織的陽性表達率顯著高于癌旁正常黏膜，與文獻報道的基本一致［11-12］。根據AJCC指南，發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移的CRC患者至少屬于Ⅲ期［13］，所以淋巴結轉移是CRC晚期患者的重要條件。為了更好評價MACC1在CRC侵襲轉移中的作用，本研究以有無淋巴結轉移為切入點，采用單因素分析可能與CRC淋巴結轉移的高危因素。結果發(fā)現腫瘤分化程度、腫瘤大小、浸潤深度、MACC1陽性表達、神經侵犯和臨床分期等都可能是CRC淋巴結轉移的高危因素。一般來說，腫瘤體積越大、瘤組織分化越差、出現淋巴結轉移、神經侵犯和臨床分期越晚，都與CRC不良預后密切相關，代表腫瘤細胞具有更強的侵襲力和轉移特性［14］。本研究分析出來的與CRC淋巴結轉移可能的高危因素基本上與文獻報道符合［15］。

STEIN等［4］報道MACC1可以作為預測結腸癌轉移的獨立指標。本研究對可能是影響CRC淋巴結轉移的6個高危因素進行Logistic回歸分析，發(fā)現MACC1異常高表達、神經侵犯、浸潤深度和臨床分期是結直腸癌淋巴結轉移的獨立危險因素，在組織學水平證實了MACC1是CRC發(fā)生淋巴結轉移的獨立危險因素。在細胞水平，本研究發(fā)現MACC1在高淋巴結轉移潛能的SW620細胞中高表達，在低淋巴結轉移潛能的SW480細胞中低表達。SW620和SW480細胞系是從同一個大腸癌患者復發(fā)淋巴結病灶和原發(fā)病灶原代培養(yǎng)獲得，兩者具有一致的遺傳學背景，因此為研究CRC淋巴結轉移相關機制提供了一個合適的模型［16］。本研究這些結果綜合提示MACC1蛋白高表達是CRC發(fā)生淋巴結轉移的獨立危險因素，與CRC的侵襲和轉移行為密切相關。

綜上所述，MACC1在CRC組織中表達明顯增高，是CRC發(fā)生淋巴結轉移的獨立危險因素，提示MACC1在CRC中的表達增強，促使癌細胞具有更強的侵襲和轉移能力，參與了結直腸癌的惡性進展，但本研究只是初步從組織及細胞水平探討了MACC1與CRC淋巴結轉移的關系，具體機制仍然有待后續(xù)研究深入探討CRC中以MACC1為核心的上下游侵襲、轉移調控機制，特別是與miRNA的靶向調節(jié)關系，以望為闡明CRC侵襲、轉移機制及靶向基因治療提供新的基礎及策略。