STAT3和STAT4基因單核苷酸多態性與肝細胞癌的相關性

范敬靜 常彩芳 王浩

河北北方學院附屬第一醫院感染科（河北張家口075000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率分別位居惡性腫瘤第五位和第三位［1］。全球范圍內每年新發HCC病例約63萬例，其中超過一半發生在中國［4］。信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）和信號轉導與轉錄激活因子4（signal transducers and activators of transcription 4，STAT4）在肝癌細胞生長、凋亡調控過程中均發揮重要作用［3-4］。近年研究發現STAT3基因rs2293152位點和STAT4基因rs7574865位點單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNPs）可影響個體 HCC 的遺傳易感性［5-8］。但rs2293152、rs7574865位點SNPs與環境因素在HCC發病中是否存在交互作用，目前國內外鮮有報道。本研究擬采用病例對照研究方法，探究rs2293152、rs7574865位點SNPs與HCC遺傳易感性的關聯及與環境因素的交互作用，以期為HCC防治提供參考依據。

1 對象與方法

1.1研究對象經醫院醫學倫理委員會批準，采用以醫院為基礎1∶1配比病例對照研究方法，選取2013年1月至2017年12月于河北北方學院附屬第一醫院診治的經肝組織病理切片確診的新發HCC患者256例作為觀察組。依據性別、年齡（±3歲）與觀察組病例進行頻數匹配的原則，選取同期在河北北方學院附屬第一醫院體檢的健康人群256例作為對照組。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2DNA提取和SNPs檢測采集所有研究對象空腹外周靜脈血5 mL，DNA提取使用血液基因組柱式提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）。SNPs檢測使用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術。PCR擴增引物：STAT3基因rs2293152位點正向引物序列 5′-TCCCCTGTGATTCAGATCCC-3′、反向引物序列 5′-CATTCCCACATCTCTGCTCC-3′；STAT4基因rs7574865位點正向引物序列5′-AAAGAAGTGGGATAAAAAGAAGTTTG-3′、反向引物序列 5′-CCACTGAAATAAGATAACCACTGT-3′。PCR 反應體系包括：模板DNA 100 ng，正向、反向引物各0.5 μmol，MgCl21.5 mmol，Taq DNA聚合酶0.65 U，dNTP 0.2 mmol，總反應體系為25 μL。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環；72℃延伸5 min。對rs2293152、rs7574865位點的PCR產物分別加入HpaII和HpaI內切酶。產物使用3%瓊脂糖凝膠進行電泳，在紫外分析儀下觀察并記錄結果，同時從研究的DNA樣本隨機抽取5%進行重檢，以確保檢測結果的準確性。

1.3資料收集根據相關文獻資料，由經過統一培訓的研究人員收集所有研究對象的一般人口學信息及HCC環境危險因素，包括年齡、性別、吸煙、飲酒、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染及HCC家族史。吸煙定義為累積吸煙＞100支或超過3年每周至少1 d以上（＞15 min/d）吸入香煙燃燒所產生的煙霧［9］；飲酒定義為連續或累積飲酒時間超過6個月，平均每日攝入酒精量≥50 g，酒精攝入量＝酒精度×攝入體積×0.8；HCC家族史定義為研究對象的一級、二級或三級親屬中有HCC患者［10］。

1.4統計學方法應用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析。計量資料以表示，組間比較采用Student'st檢驗；計數資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Haploview 4.2軟件檢驗基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。采用二分類Logistic回歸模型分析rs2293152、rs7574865位點SNPs與HCC遺傳易感性的關聯及與環境因素間的交互作用，以比值比（odds ratio，OR）及95%置信區間（confidence interval，CI）來表示關聯強度，檢驗水準α＝0.05。雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兩組間一般資料比較兩組在年齡、性別構成方面，差異無統計學意義（P＞0.05）；而在吸煙、飲酒、HBV感染及HCC家族史方面，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2兩組間rs2293152、rs7574865位點基因型分布比較兩組rs2293152、rs7574865位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（rs2293152：χ2＝0.432，P＝0.511；rs7574865：χ2＝0.112，P＝0.737），具有群體代表意義。兩組間rs2293152、rs7574865位點基因型分布差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 兩組間一般資料比較Tab.1 Distributions of general clinical characteristics in the two groups 例（%）

表2 兩組間rs2293152、rs7574865位點基因型分布比較Tab.2 Genotypes frequency distribution of rs2293152，rs7574865 between the two groups 例（%）

2.3rs2293152、rs7574865位點SNPs與HCC遺傳易感性關聯分析經二分類Logistic回歸模型校正年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染、HCC家族史后發現，與rs2293152位點CC基因型相比，GG型可顯著增加HCC的發病風險（OR＝1.682，95%CI：1.206～3.445，P＝0.031）；與GC+CC基因型相比，GG型亦可顯著增加HCC的發病風險（OR＝2.201，95%CI：1.694～3.815，P＝0.028）；與C等位基因相比，G等位基因可顯著增加HCC的發病風險（OR＝1.328，95%CI：1.039～1.654，P＝0.021）。與rs7574865位點TT基因型相比，GG型可顯著增加HCC 的 發 病風 險（OR＝1.761，95%CI：1.027～3.020，P＝0.040）；與GT+TT基因型相比，GG型亦可顯著增加HCC的發病風險（OR＝2.333，95%CI：1.209～4.503，P＝0.012）；與T等位基因相比，G等位基因可顯著增加HCC的發病風險（OR＝1.409，95%CI：1.057～1.878，P＝0.019），見表3。

2.4分層分析本研究基于兩組間一般資料比較結果，以吸煙、飲酒、HBV感染及HCC家族史進行分層分析顯示，在飲酒人群中rs2293152位點GG基因型相比GC+CC基因型HCC發病風險顯著升高（OR＝1.923，95%CI：1.241～3.562，P＝0.044），在HBV感染人群中rs2293152位點GG基因型相比GC+CC基因型HCC發病風險亦顯著升高（OR＝2.216，95%CI：1.136～3.197，P＝0.031），見表4；在飲酒人群中rs7574865位點GG基因型相比GT+TT基因型HCC發病風險顯著升高（OR＝1.234，95%CI：1.051～1.448，P＝0.010），在 HBV 感染人群中rs7574865位點GG基因型相比GT+TT基因型HCC發病風險亦顯著升高（OR＝2.181，95%CI：1.122～4.243，P＝0.022），見表5。

表3 rs2293152、rs7574865位點SNPs與HCC遺傳易感性關聯分析Tab.3 The associations between SNPs of rs229315，rs7574865 and the hereditary susceptibility of HCC 例

2.5rs2293152、rs7574865位點SNPs與環境因素的交互作用分析經二分類Logistic回歸模型分析rs2293152、rs7574865位點SNPs與環境因素的交互作用發現，rs2293152位點SNPs與飲酒（OR＝1.314，95%CI：1.125～1.649，P＝0.046）及 HBV 感染（OR＝3.102，95%CI：1.014～9.487，P＝0.027）間均存在正交互作用；rs7574865位點SNPs與飲酒（OR＝1.085，95%CI：1.017～1.158，P＝0.013）及HBV感染（OR＝4.778，95%CI：1.687～13.535，P＝0.003）間亦均存在正交互作用，見表6。

表4 rs2293152位點分層分析結果Tab.4 Results of rs2293152 stratification analyses 例（%）

表5 rs7574865位點分層分析結果Tab.5 Results of rs7574865 stratification analyses 例（%）

表6 rs2293152、rs7574865位點SNPs與環境因素的交互作用分析Tab.6 Results of gene-environment interaction analyses

3 討論

STAT家族可將細胞外信號傳遞至細胞核內，發揮轉錄激活作用，其中STAT3、STAT4作為Janus激酶（JAK）/STAT信號通路中的關鍵轉錄激活因子，可促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡、誘導腫瘤新生血管生成，在HCC發生、發展及轉移過程中均發揮重要作用［3-4］。個體遺傳背景的差異亦與HCC發病密切相關，而SNPs能充分反映個體間的遺傳差異，決定了個體對疾病的易感性，正成為研究HCC遺傳易感性的重要工具，近年研究表明STAT3基因rs2293152位點和STAT4基因rs7574865位點SNPs與HCC發病風險存在一定的關聯［5-6］。本研究采用病例對照研究方法，通過比較HCC患者與健康對照中rs2293152、rs7574865位點等位基因及基因型的差異，發現rs2293152位點G等位基因、GG基因型和rs7574865位點G等位基因、GG基因型均可顯著增加HCC發病風險，與XIE等［8］和CHANTHRA等［11］研究結果相符，表明rs2293152、rs7574865位點SNPs與HCC遺傳易感性明顯相關。

HCC是由環境因素與遺傳因素共同作用發展而來的復雜惡性疾病［12］，但飲酒、HBV感染等環境因素與rs2293152、rs7574865位點SNPs間的交互作用是否影響HCC的發病，目前尚未見相關的研究。飲酒與HCC的發生密切相關，一方面酒中的乙醇在肝臟中代謝所產生的中間產物乙醛會直接毒害肝細胞，另一方面乙醇可誘導微粒體乙醇氧化酶系的主要成分細胞色素P450E1活化外源性致癌物，使氧離子和過氧化氫等活性氧基團生成增多，氧化應激增強，導致肝損傷，加速肝纖維化進而誘發HCC［13］。本研究經分層分析發現，在飲酒人群中rs2293152位點GG基因型相比GC+CC基因型，rs7574865位點GG基因型相比GT+TT基因型，HCC發病風險顯著升高，并通過交互作用分析進一步指出rs2293152、rs7574865位點SNPs與飲酒的正交互作用，能夠增加HCC發病風險。HBV感染是我國HCC最主要的危險因素，既可導致慢性乙型病毒性肝炎引起肝組織的炎癥、纖維化及壞死等間接促進HCC發病，又能以HBV脫氧核糖核酸與肝細胞脫氧核糖核酸整合，使肝細胞基因發生突變，直接增加HCC發病風險［14-16］。本研究經分層分析發現，在HBV感染人群中rs2293152位點GG基因型相比GC+CC基因型，rs7574865位點GG基因型相比GT+TT基因型，HCC發病風險顯著升高，并通過交互作用分析進一步指出rs2293152、rs7574865位點SNPs與HBV感染的正交互作用能夠增加HCC發病風險。

綜上所述，STAT3基因rs2293152位點和STAT4基因rs7574865位點SNPs與HCC遺傳易感性明顯相關，并與飲酒、HBV感染存在正交互作用，可增加HCC發病風險。因此，本研究可提供科學的理論依據指導HCC進行一級預防，對HCC高危人群開展rs2293152、rs7574865位點SNPs篩查，針對rs2293152位點G等位基因、rs7574865位點G等位基因攜帶者，建議戒酒、加強HBV感染防控，從而遏制HCC的發病。