昭通青花椒總生物堿含量測定

熊汝琴，李才濤

（昭通學院 化學化工學院，云南 昭通 657000）

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）為蕓香科花椒屬植物的果皮，不僅是常用調味品之一，而且具有芳香健胃、溫中散寒、除濕止痛、殺蟲解毒、止癢解腥等藥效。目前，國內外學者對花椒化學成分及藥理活性研究已十分成熟，研究表明花椒中主要含有揮發油、酰胺、生物堿、黃酮、多酚、香豆素、木脂素等多種化學成分[1-2]。其中生物堿是花椒中普遍存在的一類活性成分，迄今為止，從花椒中已分離得到二十余種生物堿，如青花椒堿、茵芋堿、白蘚堿、喹諾酮喹啉生物堿、γ-花椒堿、鐵屎米-6-酮、白屈菜紅堿等[3-5]。藥理研究表明，花椒總生物堿具有較寬的抗菌譜，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和釀酒酵母均有抑制作用，還具有抗炎、鎮痛、抗腫瘤、抗瘧疾、抑制血小板凝集等作用[5-7]，是反映花椒內在品質的主要指標。

花椒是經濟價值、藥用價值和生態價值較高的農產品，在我國栽培歷史悠久，分布范圍廣泛，昭通地區的產量約占全省的60～70%。昭通市花椒品種有“大紅袍”和青花椒兩種，其中青花椒人工種植規模較大，主要分布在永善縣、魯甸縣、彝良縣、巧家縣、鹽津縣、大關縣等地區。近年來隨著國家提倡振興特色農業發展，昭通市各級政府高度重視青花椒產業發展，引進新技術發展地方特色農業，青花椒作為地方經濟產業支柱，種植規模不斷擴大。目前，昭通市花椒產值達 10多億元，昭通已經成為國內三大青花椒集散地之一。

目前，對花椒生物堿的研究報道主要集中于四川、重慶、陜西等地區所產花椒[8-9]，但是，由于各地地域不同導致的氣候、雨量、日照和土質等很多自然因素存在很大差異，不同產地花椒生物堿含量有很大差異。而昭通青花椒的種植面積雖不斷擴大，但對其生物堿含量的系統研究卻鮮有報道，缺乏理論數據的支撐，加上臨近四川、重慶等花椒種植基地，使得昭通青花椒的市場競爭力較弱，品牌效應不高。本次研究將對昭通地區魯甸縣、彝良縣、永善縣、大關縣、鹽津縣、巧家縣六個青花椒主要種植縣所產青花椒生物堿進行提取測定，分析昭通地區不同海拔高度及地理環境所產青花椒的生物堿含量，并與其它產地青花椒進行對比，期望為昭通青花椒的質量評價提供基礎數據，增加花椒用途，提升價格，帶動花椒產區經濟發展。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；先行者電子分析天平；XFB-200家用粉碎機（吉首市中湘制藥機械廠）；PHS-3C型數顯酸度計（濰坊金水華禹信息科技有限公司）；HH-S型恒溫水浴鍋；UNIC7200可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；移液槍。

1.2 材料與試劑：

青花椒樣品分別采于昭通市魯甸縣梭山鎮，巧家縣大寨鄉，彝良縣角奎鎮，永善縣黃華鎮、鹽津縣廟壩鎮、大關縣高橋鎮。白屈菜紅堿標準品（江蘇永健醫藥科技有限公司）；碘化鉍鉀；磷酸二氫鈉；磷酸氫二鈉；無水乙醇；氯仿（均為分析純）。

2 實驗方法

2.1 試液配制

2.1.1 pH值=7.6的溴甲酚綠磷酸緩沖液的配制

準確稱取Na2HPO417.90g，溶解定容至250mL容量瓶中，其濃度為0.2mol/L，準確稱取NaH2PO41.56g，溶解定容至50mL容量瓶中，其濃度為0.2mol/L。分別取NaH2PO4溶液87mL，NaH2PO4溶液13mL，稱取0.05g溴甲酚綠定容至100mL；即配制成pH值=7.6的溴甲酚綠磷酸緩沖液。

2.1.2 碘化鉍鉀溶液的配制

準確稱取碘化鉍鉀2.00g，加入20mL冰醋酸充分溶解后加入50mL水稀釋即可。

2.1.3 標準溶液的配制

準確稱取5.00mg白屈菜紅堿標準品，加無水乙醇定容至25mL，制得0.2mg/mL白屈菜紅堿標準溶液。

2.2 標準曲線的建立

準確吸取取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL白屈菜紅堿標準溶液于5支規格為25mL的試管中，先加入一定量蒸餾水補至5mL，再加入2mL溴甲酚綠磷酸緩沖液，最后加氯仿10mL。振蕩2分鐘后，分別倒入干燥潔凈的分液漏斗中充分搖勻后靜置1小時。待溶液分層后，取氯仿層(下層)在425nm波長下測定吸光度值，建立標準曲線[10]。

2.3 樣品處理

將昭通六縣區所產青花椒果皮干至恒重，分別用粉碎機粉碎后過60目篩，精確稱取5.0g粉末倒入具塞錐形瓶中，平行稱三份，加70%乙醇溶液75mL，用稀鹽酸溶液調節pH=3，室溫浸提5小時后過濾。用濃氨水將濾液調節至中性，分別取5mL濾液于5支試管中，再分別加入2mL溴甲酚綠磷酸緩沖液和10mL氯仿，振蕩2分鐘后，倒入分液漏斗中充分搖勻靜置1小時。取分液漏斗上層液1mL，加入1mL碘化鉍鉀溶液，若有橘紅色沉淀生成則繼續加氯仿至生物堿萃取完全，取氯仿層在425nm波長處測吸光度[11-12]。

3 結果與分析

3.1 標準曲線方程

以白屈菜紅堿質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為y= 4.615x + 0.0044，線性相關系數r=0.9994，說明白屈菜紅堿質量濃度在0～0.2 mg/mL與吸光度呈良好的線性關系，該方程可用于青花椒總生物堿含量測定。

圖1 生物堿測定標準曲線

3.2 穩定性實驗

取制備好的供試溶液，按前述2.2測定方法，在樣品液與顯色劑反應完全后，分別在0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h連續測定吸光度，所測吸光度值的相對標準偏差RSD為1.56%，說明顯色后的溶液在3.0h內穩定。

3.3 精密度實驗

取制備好的供試溶液，按前述2.2測定方法，重復測定5次，記錄吸光度值，相對標準偏差RSD為0.32%，表明儀器精密度高。

3.4 重現性實驗

分別稱取魯甸縣所產青花椒樣品粉末5份，每份5.0g，按2.3項方法處理后獲得供試溶液，再按2.2項方法測定吸光度值，相對標準偏差RSD為1.35%，表明重復性高。

3.5 昭通青花椒總生物堿含量

分別稱取昭通六縣區所產青花椒干燥果皮粉末5.0g，按前述方法提取其中總生物堿制備待測溶液，采用酸性染料比色法測定吸光度值，并根據標準曲線計算總生物堿含量，結果見表1。

表1 昭通六縣區青花椒生物堿含量

從表中可見，昭通地區六縣所產青花椒中總生物堿含量在0.343%～0.430%之間，沒有顯著差異。

4 小結與討論

本文以白屈菜紅堿為標準品繪制標準曲線。根據生物堿可與酸反應生成鹽，使其在乙醇中的溶解度增大，用70%乙醇溶液并加稀鹽酸調節pH為酸性，充分浸提過濾后，用濃氨水將濾液調節至中性，氯仿萃取生物堿后加溴甲酚綠磷酸緩沖液顯色，于425nm波長處測吸光度。實驗結果表明，昭通市六縣區所產青花椒中總生物堿含量在0.343%～0.430%之間，沒有顯著差異，本文為昭通青花椒的進一步開發利用提供理論依據。