血睪屏障中支持細胞間緊密連接結構和功能的研究進展

陳楸蕗 劉 明 陳德宇*

( 1．阜陽師范學院附屬中學，安徽 阜陽 236041；2．阜陽師范學院生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037 )

在睪丸中，生精小管和血液之間存在著血睪屏障(bloodtestis barrier，BTB)，其組成包括間質的毛細血管內皮及其基膜、結締組織、生精上皮基膜和支持細胞間的緊密連接( tight junction，TJ)，TJ是構成BTB的主要結構[1]。支持細胞緊密連接異常導致生精細胞在生精小管內的移行受阻可能是寡精癥的病因之一[2]。精子發生是一個極其復雜的過程，在細胞、生物化學和分子水平上受到不同分子和不同通路的調節。因此，揭示BTB內TJ動力學過程及其在重建過程中的調節機制，有利于理清精子發生的機制。本綜述重點分析血睪屏障中支持細胞間緊密連接的結構和功能。

1 支持細胞

1.1 支持細胞的結構

支持細胞(Sertoli cells)是為發育中的精子提供保護和營養的細胞，精子發育的各個階段均發生在支持細胞之間。支持細胞呈錐體形，形狀不規則，細胞基部緊貼基底膜，頂部可以到達生精小管的管腔，細胞側面和腔面凹凸交錯，相鄰細胞間鑲嵌著各級生精細胞，細胞側面近基部的相鄰細胞膜形成TJ，將生精上皮分成基底室和近腔室。基底室位于生精上皮基膜和支持細胞TJ之間，內有A型和B型精原細胞；近腔室靠近生精小管管腔，含有精子細胞和精子[3]。精子發生時B型精原干細胞分化到精母細胞需要跨越TJ進入近腔室，才能進一步的發育成成熟精子(結構示意圖見圖1)[4-5]。因此，精子發生時生殖細胞穿越生精上皮的運動同TJ的結構重建密切相關。

1.2 支持細胞的功能

支持細胞的功能主要包括：提供結構性支持；創建形成血睪屏障；參與生殖細胞的運動和排精；通過分泌產物滋養生殖細胞等[6]。

圖1 精子發生時生精細胞穿越TJ模式圖[4]

1.2.1 結構性支持 支持細胞有著豐富的細胞骨架。這些細胞骨架在維持支持細胞形狀、細胞器定位、細胞連接的形成、定位錨定輔助生精細胞的運動以及精子的釋放中起著重要作用[7]。它由肌動蛋白、中間絲和微管組成。肌動蛋白絲由相對分子質量為42 kDa的肌動蛋白單體組成，單體聚合成8 nm寬的螺旋線性鏈。有兩種肌動蛋白單體，肌動蛋白G和肌動蛋白F。中間絲聚集于細胞外基質附著部位，參與橋粒連接和半橋粒連接。微管由微管蛋白構成，已經確定了至少6種微管蛋白，包括α、β、δ、ε、γ和ξ[8-12]。

1.2.2 形成血睪屏障 血睪屏障又稱生精上皮屏障，位于生精上皮基底三分之一的支持細胞緊密連接處。血睪屏障將生精上皮劃分成兩個隔室，一個是基底室，內有精原細胞、細線前期細胞和細線期細胞。另一近腔室內含有精子細胞[13]。

血睪屏障有3個主要功能：創造一個專門的微環境；調節分子的通過；用作免疫屏障[14]。首先，血睪屏障創造的微環境有利于生殖細胞發育和運動。比如，生殖細胞位于管腔內無法獲得血清鐵，但支持細胞可以將其合成的轉鐵蛋白分泌至微環境內，供生精細胞生長發育。營養物質和廢物進出生精上皮主要靠血睪屏障的調節。血睪屏障創建了一個免疫屏障，確保免疫系統不能識別存在于生殖細胞表面的特異性抗原。最近的研究表明，支持細胞和生殖細胞通過產生干擾素(interferon，IFN)、白介素(interleukins，ILs)和細胞因子來維持獨特的防御系統。血睪屏障也阻止免疫球蛋白和淋巴細胞進入近腔室[15-17]。

與血腦屏障相比較，血睪屏障的不同之處在于它必須定期開啟，以保證精子發生過程中生殖細胞的通過。例如，發育中的細線前期/細線期的精母細胞必須穿過血睪屏障。這個過程牽涉到緊密連接的解離和重組。但生殖細胞在血睪屏障內的運動機制未被充分解析。另外調節血睪屏障形成和維持其穩定的因素目前還不清楚。其主要原因是關于血睪屏障生物學信息的缺乏，以及缺乏適合用來研究支持細胞緊密連接動力學的體外和體內模型[18]。

1.2.3 協助生殖細胞移位 支持細胞直接參與生精細胞的運動，因為生精細胞缺乏遷移細胞的結構特征。生殖細胞運動的潛在機制可能涉及三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)酶超家族的成員。有研究表明伸長/延長的精子細胞跨生精上皮的易位主要是由胞外基質賦予的。微管連同幾種運動相關蛋白，如動力蛋白、肌球蛋白VIIa、腺嘌呤核苷三磷酸酶和GTP酶協助精子細胞在生精上皮內遷移。不過仍有許多問題需進一步解答。比如，如果生殖細胞的運動必須與它們的發育狀態相一致，那么什么信號決定了上皮周期中精細胞在上皮細胞中的適時運動？什么是調節外質特化重組的機制？當細胞需要向前移動時，如何向支持細胞發出信號？要回答這些問題，必須完全闡明胞外基質的生物化學結構。另外支持細胞也協助早期減數分裂的精母細胞從基底到腔室的移位。這一過程可能需要支持細胞間和支持-生殖細胞連接的分解與重新組裝，是一個高度選擇性的過程。比如A型精原干細胞必須保留在基底膜上，不能移動。這就需要一個高效的選擇機制來確定哪些特定類型的細胞可以穿越生精上皮[19]。

1.2.4 排精 這個過程涉及一系列細胞生物學事件，包括：支持細胞細胞質包裹精細胞；從支持細胞近腔端驅離精子細胞；精細胞的釋放。

1.2.5 吞噬 精子細胞變態成精子過程中釋放出來的殘余成分，以及在精子發生過程中退化的生殖細胞都由支持細胞負責吞噬清理[20]。

1.2.6 提供營養 支持細胞合成的氨基酸、碳水化合物、脂質、維生素和金屬離子需要足量地遞送到血睪屏障后面的精子細胞和精子中。營養物質從支持細胞轉移到生殖細胞理論上是可能的。單獨培養生殖細胞時，最多存活24 h，如果與支持細胞共培養，生殖細胞可以在體外存活達8 d左右。這一現象提示支持細胞可以給生精細胞提供養分[21]。

2 緊密連接

在睪丸中，緊密連接是由原纖維組成的相鄰細胞的質膜(通常為50~100個)完全包圍每個細胞的基底區域之間緊密接觸的區域。其主要成分是occludin和claudin蛋白[22]。與在其他上皮細胞形成的緊密連接不同，睪丸中緊密連接的連接位置獨特，因為它們最接近基底膜，基底膜是細胞外基質的修飾形式。

2.1 緊密連接的功能

緊密連接有兩個主要功能：形成屏障以及形成相對封閉的空間。首先，緊密連接會產生一個半滲透的屏障，限制分子的通過。分子的通過在很大程度上取決于它們的相對分子質量和化學性質。實際上，為適應不同器官的生理需求，緊密連接的滲透性在不同組織中不一樣，且可以調節。蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑原釩酸鈉能夠干擾MDCK細胞緊密連接的通透性，表明蛋白酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶抑制劑可能干擾支持細胞緊密連接屏障的裝配。其次，睪丸中緊密連接形成的邊界將支持細胞分成基底和近腔兩部分，這被稱為緊密連接的圍欄功能。該功能賦予上皮細胞的極性。緊密連接的柵欄功能阻止了兩個區域之間的分子如蛋白質和脂質的混合[23]。

2.2 緊密連接相關的蛋白

2.2.1 ZO-1 ZO-1是一種210~225 kDa的外周膜蛋白，與上皮細胞和內皮細胞中的緊密連接相關。ZO-1與occludin的C末端相連，ZO-1與occludin的化學計量比為1∶1。ZO-1還與上皮細胞和非上皮細胞中的肌動蛋白和α-連環蛋白相關聯，當上皮細胞的緊密連接受到損害時，ZO-1從緊密連接部位解離并返回胞內。這個過程是由肌動蛋白細胞骨架介導的。在睪丸中，ZO-1幾乎完全定位于血睪屏障的支持細胞緊密連接處。研究表明[24]， ZO-1有兩種不同的異構體a-和 a+，它們分別是mRNA選擇性剪接的不同產物。ZO-1a-和ZO-1a+分別在成年期和青春期表達，表明這些同種型對于緊密連接解體和組裝至關重要。除occludin外，ZO-1還可與其他蛋白如F-actin、JAM、claudin-1、cingulin、spectrin、PAR-3和Rab8等相結合[25]。

2.2.2 ZO-2 ZO-2的相對分子質量為160 kDa，定位于睪丸內。ZO-2的3個MAGUK結構域與ZO-1有51%的同源性，但C端僅有25%的同源性。ZO-2可以被PKC-t，-c，-h磷酸化，說明它可以被蛋白激酶激活。其他體外和體內研究已經證明ZO-2能夠結合occludin和claudin蛋白[26]。一些報道還證實了ZO-2能夠與F-肌動蛋白和α-連環蛋白的關聯，提示該分子也可能參與黏附連接的調節[27]。

2.2.3 ZO-3 ZO-3首先被鑒定為MDCK細胞中的130 kDa多肽并命名為p130，隨后的研究發現它與ZO-1及ZO-2有高度同源性，因此被重新命名為ZO-3。在MDCK細胞中，ZO-3與ZO-1和ZO-2一樣，在絲氨酸和酪氨酸殘基上都可以磷酸化。免疫熒光顯微結果和免疫電鏡顯微結果均顯示ZO-3與ZO-1共定位于緊密連接處。其他研究發現它與occludin、claudin、actin和Pals1相關的緊密連接蛋白相互作用，但與ZO-2不相關[28]。

2.2.4 occludin蛋白 occludin是裝配緊密連接的重要蛋白質[29]。人的occludin基因定位于5q13.1，其相對分子質量為64 kDa，由504個氨基酸組成，共有4個跨膜結構域，其羧基端和氨基端都位于胞膜內的胞質區，細胞膜外有2個細胞外環，它們富含絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基，分別叫Occ-1和Occ-2。Occ-1有由大約60%的酪氨酸和甘氨酸殘基組成，能夠形成疏水結構，相鄰Sertoli’s細胞間的Occ-1外環交錯形成封閉區域，參與細胞間黏附；Occ-2對緊密連接有特異性的調控功能，是組裝進緊密連接的必需結構域，參與旁細胞屏障的形成(其分子結構見圖2)。相鄰支持細胞occludin的胞外環通過“親吻式接觸”，以拉鏈結構開啟或關閉細胞的緊密連接[30](其結構見圖3)。occludin蛋白與多種疾病相關：在腸上皮中，occludin 組裝的TJ起著保護腸黏膜的作用，occludin表達異常會出現腸炎腹瀉等癥狀[31]；作為血腦屏障的組分，occludin表達異常會引起血-腦屏障的功能紊亂[32]；作為上皮保護屏障，occludin與病毒感染相關[33-34]；腫瘤細胞的浸潤和轉移與細胞間連接力的喪失有關，occludin下調或缺失會加速腫瘤細胞發生和轉移[35]；作為TJ的組分，occludin是生精上皮中支持細胞間形成TJ結構的基礎，其程序性的開啟與關閉保證了精子發生正常進行，若異常開放則會影響精子發生的正常進程。干擾睪丸支持細胞內occludin蛋白的功能狀態，會導致不育[36-37]。BTB的TJ不同于血腦屏障及其他屏障的TJ，它關系到精原細胞在支持細胞間的運行及分化，牽涉到支持細胞間TJ的瓦解和重建，但其調控機制未見深入報道。因此研究和探討TJ瓦解和重建的分子機制，特別是分析occludin在此過程中的動態進程，對進一步了解精子發生的分子機制及寡精癥病因的解析具有重要意義。

2.2.5 claudin蛋白 claudin超家族至少有24種蛋白，是緊密連接的主要構件之一，它完全定位于緊密連接部位。claudin的拓撲結構與occludin相似，除了claudin的細胞質結構域和第二個細胞外環明顯更小以外，不同的claudin蛋白與occludin并無任何顯著的序列同源性。每種claudin的表達模式在不同的組織中差異很大。claudin 11主要表達于睪丸和大腦，在腎臟中也幾乎檢測不到。claudins是否磷酸化尚不清楚，但claudins的C末端含有蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、酪蛋白激酶2和cAMP依賴性蛋白激酶的磷酸化位點。事實上，各種claudins之間的最大差異在于它們的C端，這表明claudins的C末端是參與不同器官中緊密連接的關鍵位點。C末端的最后兩個氨基酸殘基Tyr-Val存在于大多數claudins中，是它們與PDZ結構域相互作用所必需的氨基酸。研究表明細胞在任何時候都可以表達兩種以上的claudin蛋白，而且兩種細胞之間不同claudin蛋白的組合決定了緊密連接的通透性和物理尺寸[38]。這決定了不同細胞和組織緊密連接的獨特性質。睪丸內有7種不同的claudins，即claudins 1、3~5、7~8和11。claudin 11是睪丸中唯一被詳細研究的緊密連接蛋白，僅定位于支持細胞的血睪屏障部位。在小鼠睪丸中，claudin 11表達模式與出生后第6~16天的血睪屏障的組裝一致，并且在FSH和TNF-α的作用下其在支持細胞中的表達可被抑制。更重要的是，基因敲除實驗證明缺乏claudins 11的小鼠是不育的[39]，表明血睪屏障的完整性對于正常精子發生至關重要。

圖2 occludin分子結構模式圖[29]

圖3 相鄰支持細胞occludin形成TJ模式圖[29]

2.2.6 JAMs JAM是新近研究的免疫球蛋白超家族成員，主要定位于上皮細胞和內皮細胞緊密連接部位。不過尚無確切實驗證明JAM是否是緊密連接的實際組成部分。到目前為止，已經確定了3個JAM成員，即JAM 1~3，Northern印跡證明了JAM1和2在睪丸中的表達[40]。JAM與occludin、ZO-1和cingulin共定位。其他報道[41]表明，JAM與AF-6、ASIP / PAR-3、MUPP1蛋白和鈣/鈣調蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶相關。使用抗JAM抗體后，白細胞通過內皮細胞的遷移被抑制；TNF-α和IFN-γ的摻入會導致JAM在細胞內的再分布，可以增強白細胞在臍靜脈內皮細胞上的遷移[42]。這些結果提示JAM與細胞運動相關。但JAM如何調控生精細胞的遷移，有待進一步研究。

2.2.7 柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR)CAR是一種46 kDa的跨膜蛋白，具有跨膜、胞質區、胞外區域和兩個免疫球蛋白樣結構域。雖然現在推測CAR在緊密連接動力學中的功能還為時過早，但CAR能夠介導病毒附著和感染。例如，柯薩奇病毒和腺病毒是兩種腸道病毒，其在感染過程中穿過上皮(胃腸道或呼吸道)中的緊密連接處，導致緊密連接完整性的喪失，然后運行到心臟和大腦。其運行機制可能與JAM(最近被確定為哺乳動物呼腸孤病毒的受體)和claudin(也可以作為產氣莢膜梭菌腸毒素的受體)類似。在非極化細胞中，CAR定位于細胞間接觸處，說明CAR可促進細胞黏附。在極化的上皮細胞中，CAR和ZO-1共定位在緊密連接部位。CAR的過表達能夠增強屏障功能。最近研究發現CAR在小鼠的生殖細胞中有表達，但其在支持細胞中的功能仍有待確定[43]。

2.2.8 其他蛋白 在緊密連接部位陸續發現了幾個其他緊密連接相關蛋白：Cingulin、symplekin、血影蛋白/胞影蛋白、7H6、AF-6、PAR-6、非典型PKC、Sec 6、Sec 8、Rab13、ab3B、ZONAB、ASH1、19B1、ASIP、MAGI蛋白和WNK1激酶。

3 展 望

關于連接動力學的研究已經成熟，研究人員對確定連接處復合物是如何被組合成能緊密和黏附連接點感興趣。有關緊密結合和生殖細胞運動之間的相互關系有幾個問題仍不清楚。例如，一個典型的上皮細胞如何感知極性/方向，使得緊密和黏連連接可以被正確組裝？細胞連接裝配/拆卸與內吞之間是否有聯系？底層肌動蛋白細胞骨架涉及到什么程度？大多數情況下，細胞連接以這樣的方式組裝，即它們可以固有區分上皮細胞的頂端區域和基底外側區域。體外的緊密連接也需要在膜表面積上急劇增加，最終形成一個高的柱狀上皮。此外，在緊密連接組裝之前，功能性黏連連接必須首先被組裝，相關蛋白如何順序性執行功能仍有待深入探討。這些問題的解答對于精子發生的闡釋具有重要意義。