土壤中Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）生態毒性的差異性研究

于修樂，馬義兵，2，孫宗全，李合蓮，李士偉，韓雪梅*

（1.濟南大學水利與環境學院，濟南 250022；2.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

鉻（Cr）在自然環境中主要以Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）兩種價態存在[1-3]，其毒性與環境中的存在價態具有密切關系。由于Cr（Ⅵ）遷移能力較強且具有強氧化性[4]，因此人們普遍認為Cr（Ⅵ）具有更高的生態毒性[5]。許多研究結果也得出了一致的結論，如Sivaku?mar等[6]分別研究了Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）在10種土壤中對赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）的毒性，發現暴露14 d時Cr（Ⅵ）的半數致死濃度（Median lethal concentra?tion，LC50）為222～257 mg·kg-1，Cr（Ⅲ）的LC50為1656～1902 mg·kg-1，Cr（Ⅵ）對赤子愛勝蚓的毒性顯著高于Cr（Ⅲ）。梁艷茹[7]研究了Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）對塿土、褐土和風沙土脫氫酶活性的影響，發現Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）對土壤脫氫酶活性的半數有效劑量（Median effective dose，ED50）分別為50.9～81.0 mg·kg-1和2451～3415 mg·kg-1，表明在這三種土壤中Cr（Ⅵ）對脫氫酶的毒性也顯著高于Cr（Ⅲ）。然而有些學者的研究卻得出了相反的結果，如Vignati等[8]發現在淡水環境中Cr（Ⅲ）對兩種綠藻Pseudokirchneriella subcapitata和Chlorella kessleri的毒性分別大約是Cr（Ⅵ）毒性的10倍和5倍。Samborska等[9]也發現在相同濃度下Cr（Ⅲ）比Cr（Ⅵ）對土壤脲酶具有更強的抑制作用。由此可以看出，Cr的毒性除了與其價態有關之外，還受到生物受體的影響，僅就單一生物受體作為研究目標無法對不同價態Cr的綜合毒性進行準確評價。需將當前分散的基于有限物種的Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）毒性研究結果整合起來，才能從多生物指標和生態系統水平上對Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的生態毒性差異進行綜合比較。

Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的毒性除了因生物受體而異外，環境因子如土壤pH、有機碳含量（OC）、陽離子交換量（CEC）及黏土含量（clay）等也是影響Cr在環境中遷移轉化和生物有效性的重要因素，相同含量的同一價態Cr添加到不同類型土壤中對同一種生物和評價終點的毒性常常差異較大，如Cr（Ⅵ）在酸性土壤中對脲酶活性的半數有效濃度（Median effective concen?tration，EC50）為1093 mg·kg-1，在堿性土壤中的EC50卻為27 473 mg·kg-1[10]；Cr（Ⅲ）在酸性土壤中對磷酸酶活性的10%有效濃度（10%of effective concentration，EC10）為1089 mg·kg-1，而在堿性土壤中的EC10卻僅為370 mg·kg-1[11]，因此在對不同價態Cr的生態毒性差異進行分析時，還需建立各價態Cr的生態毒性與土壤性質關系的預測模型，以便于通過歸一化處理修正由于土壤性質引起的毒性差異。

在重金屬污染物對生態系統毒性的研究中，物種敏感性分布（SSD）法以其簡單明確、置信度較高、適用于各個領域以及可預測生態系統的潛在生態效應等優點[12-14]，已成為普遍應用的重要方法，該方法假設生態系統中不同物種對于某一污染物的敏感性（EC50或EC10）能夠被一個分布所描述，通過生物測試獲得的有限物種的毒性閾值是來自于該分布的樣本，可用來估算該分布的參數[14]。杜建國等[15]應用SSD方法研究了不同價態Cr對海洋生態系統（包括藻類、魚類、甲殼類、軟體動物、蠕蟲和其他無脊椎動物）的毒性，發現Cr（Ⅵ）的生態毒性大于Cr（Ⅲ）的生態毒性，且高濃度（1000 μg·L-1）水平下的 Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）生態風險差異也比低濃度（＜10 μg·L-1）時有所增大。王曉南等[16]以保定市農田潮土為研究對象，通過SSD法分析了Cr（Ⅵ）對8種土壤植物（小麥、萵苣、黃瓜、玉米、白菜、大豆、韭菜和番茄）和2種土壤動物（褐云瑪瑙螺和赤子愛勝蚓）的生態毒性，并推導出了保護生態系統中95%生物不受危害的濃度（5%of hazardous concentration，HC5）為 6.5 mg·kg-1。而目前關于Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）污染對我國土壤生態系統毒性差異的研究尚未見報道。由于土壤生態系統是由土壤植物、動物和微生物三大類群多種生物組成，物種選取上宜涵蓋每一類群和營養級[17]，且考慮到土壤環境因子對Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）毒性的潛在影響，本研究將利用文獻檢索到的基于我國土壤Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的生態毒理學數據，通過構建生態毒性預測模型修正土壤理化性質引起的Cr毒性差異，構建Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）在同一土壤條件下的SSD曲線，明確土壤中Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的生態毒性差異，為不同價態Cr污染土壤的生態風險評價和修復管理等提供參考。

1 材料與方法

1.1 Cr毒理學數據的篩選與處理

在中國知網（CNKI）、萬方學位論文、Sciencedi?rect、Web of Science、Wiley Online Library 和 Springer數據庫中以“土壤”和“Cr”或“鉻”為關鍵詞，搜索所有基于中國土壤的Cr生態毒理學數據并進行篩選。篩選的數據應滿足以下條件：實驗有合理的對照；暴露途徑均勻合理或隨機分布；實驗中條件控制始終一致；有足夠的重復和濃度梯度，便于統計分析；外源添加污染物，無復合污染等障礙因素；沒有其他明顯不合理的因素，如缺少土壤性質和評價終點等[13]。從滿足條件的文獻中直接獲取相關生物指標的EC50和EC10或利用有明顯劑量-效應關系的原始數據通過Log-logistic函數公式計算獲得。由于目前尚沒有適宜的關于土壤Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的老化和淋洗模型，無法對不同老化時間和淋洗處理的土壤進行校正，為統一條件以避免不同老化時間和是否進行淋洗處理引起的結果差異，本研究僅選用在污染物添加7 d內進行毒理學試驗的非淋洗土壤。考慮到EC50和EC10在不同土壤條件下可能存在較大差異，選取的生物指標應至少具有兩種土壤性質的EC50和EC10，但是由于中國土壤Cr對動物生態毒害數據缺乏，因此，一種土壤性質下（包括人工土壤）的動物指標依然采用；對于具有多個評價終點的同一物種，選取最重要或最敏感的評價終點作為該物種的生物毒性評價指標。

1.2 生態毒性預測模型的構建和種間外推

研究表明土壤pH、OC及CEC對土壤中重金屬元素的生物有效性和毒性有著顯著的影響[18-19]，因此，以篩選到的生物指標的EC50和EC10作為因變量，以土壤pH、OC或CEC等作為自變量，通過SPSS軟件進行多元逐步回歸分析建立不同價態Cr的生態毒性預測模型，模型的通用形式為：

式中，a、b、c表示相應的土壤參數對Cr的生態毒性的影響程度，截距k則表征該生物指標對Cr毒害的固有敏感性。

有的生物指標因缺乏足夠數據無法構建Cr生態毒性預測模型，可與已有的屬于同一類型的指標共享Cr模型，即假設Cr對共享模型的所有生物指標的毒性受土壤理化性質的影響程度是相同的，即共享模型的土壤性質參數是恒定的，差異來自于各指標本身的固有敏感性（k）。以EC50或EC10實測值與預測值之間的均方根誤差（RMSE）最小為目標，通過規劃求解獲得對應不同模型的各個指標的截距（k），此為種間外推[13]。通過預測模型計算實測土壤條件下的EC50和EC10預測值，并與實測值進行比較，分析種間外推模型的預測效果。

1.3 歸一化處理及種內變異分析

利用毒性預測模型將各土壤生物指標的EC50和EC10值歸一化到相同土壤條件下，以修正土壤性質的影響。如土壤生物指標的EC10模型為

式中，a、b表示相應的土壤參數對Cr的生態毒性的影響程度，截距k表征該生物指標對Cr毒害的固有敏感性，“nor”表示對應的參數為歸一化后的參數。

對于具有多個EC50和EC10（在不同土壤條件下測得）的某一生物指標，如歸一化后變異系數降低，則表示進行歸一化可在一定程度上修正土壤性質差異的影響[13]。

1.4 SSD曲線的建立

對于具有預測模型的生物指標，將不同土壤條件下測得的EC50和EC10值進行歸一化，并以歸一化后的EC50和EC10的幾何平均值表示；對于沒有預測模型或模型不適用的生物指標選用實測值的幾何均值。由于本研究用于構建SSD曲線的生物指標包括歸一化后的預測值和未歸一化的實測值，而未歸一化生物指標的土壤pH基本接近7，因此，將具有預測模型的生物指標歸一化到pH=7.0、OC=1.5%及CEC=15 cmol·kg-1的中性土壤條件下，以消除土壤性質差異產生的影響，便于比較和分析Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）對生態系統的毒性差異。采用BurrⅢ分布函數對Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）EC50和EC10的累積概率分布進行擬合并建立SSD曲線及其95%的置信區間。SSD曲線上某一Cr濃度所對應的累積概率表示該濃度水平Cr對生態系統的潛在影響比例（Potential affected fraction，PAF）[20]，也可根據BurrⅢ分布函數的反推公式計算已知PAF下的Cr濃度。根據置信區間的寬窄來判斷SSD曲線的擬合度，置信區間越窄表明擬合度越高[21]。

BurrⅢ分布計算PAF的公式為：

式中，b、c、k是函數的3個參數。

SSD擬合采用澳大利亞聯邦科學和工業研究組織（Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization，CSIRO）提供的計算軟件BurrliOZ（版本2.0）（http：//www.cmis.csiro.au/envir/burrlioz/）進行。

表1 基于中國土壤的Cr（Ⅵ）生態毒理學數據Table1 Ecotoxicological data of Cr（Ⅵ）based on Chinese soils

表2 基于中國土壤的Cr（Ⅲ）生態毒理學數據Table2 Ecotoxicological data of Cr（Ⅲ）based on Chinese soils

2 結果與討論

2.1 生態毒性預測模型的建立及種間外推

根據以上篩選條件，共獲得11個Cr（Ⅵ）生物指標的毒理學數據（表1）和9個Cr（Ⅲ）生物指標的毒理學數據（表2）；這些數據均基于外源添加Cr污染土壤，EC50和EC10值以外源添加的Cr濃度表示，不包括實驗土壤背景值部分。

通過多元線性回歸構建的Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的生態毒性預測模型及種間外推模型的固有敏感性如表3和表4所示。Cr（Ⅵ）對土壤脫氫酶、脲酶和堿性磷酸酶毒性的主控因素分別是土壤OC，土壤OC和CEC，以及土壤pH。對于Cr（Ⅲ）來說，土壤pH是影響其對土壤脲酶和堿性磷酸酶毒性的主控因素，土壤OC和CEC是影響其對土壤脫氫酶毒性的主控因素。表3和表4中Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）生態毒性預測模型的部分相關系數（R2）較小及土壤性質參數的正負號不統一，這可能是由于構建預測模型的數據來自不同的文獻，其土壤培養時間和測定方法之間存在差異。

利用選用的生態毒性預測模型及對應的固有敏感性計算各外推指標的EC50和EC10預測值，其實測值與預測值的關系見圖1a和圖1b。除Cr（Ⅵ）對土壤過氧化氫酶活性的EC50與EC10值超出了2倍預測區間外，其余的生物指標的實測值與預測值比值均全部或基本處于2倍預測區間內，表明這些生物指標種間外推模型的預測效果較好，可用于接下來的歸一化處理和SSD曲線構建。對于模型預測效果不理想的Cr（Ⅵ）土壤過氧化氫酶活性的EC50與EC10值以及沒有預測模型的土壤植物和動物指標的EC50和EC10值，采用實測值的幾何均值進行SSD曲線的構建。

表3 Cr（Ⅵ）EC50和EC10生態毒性預測模型及生物指標固有敏感性Table3 Ecotoxicity prediction models of EC50and EC10values of Cr（Ⅵ）and inherent sensitivity of extrapolated biological indicators

表4 Cr（Ⅲ）EC50和EC10生態毒性預測模型及生物指標固有敏感性Table4 Ecotoxicity prediction models of EC50and EC10values of Cr（Ⅲ）and inherent sensitivity of extrapolated biological indicators

2.2 種內變異分析

利用表3和表4中的模型將各土壤生物指標的EC50和EC10值歸一化到中性土壤條件下，各生物指標的種內變異結果見圖2和圖3。除Cr（Ⅵ）土壤纖維素酶活性的EC50和EC10值及芳基硫酸酯酶活性的EC50值，經毒性預測模型歸一化后變異系數略有增加，其余Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）生物指標的變異系數均顯著降低，表明通過歸一化處理可以有效消除由于土壤性質差異引起的毒性變異[13]。

2.3 中性土壤情景中Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的SSD曲線

通過BurrⅢ函數分別擬合得到Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）在中性土壤條件下的SSD曲線，見圖4。Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）各生物指標的EC50和EC10的幾何均值基本都在95%置信區間內，但存在曲線的部分區間擬合度相對較差、置信區間較寬的情況，原因可能是：這些生物指標的數據來自不同的文獻，實驗條件不統一；部分生物指標存在非歸一化等，這些都會對SSD曲線的擬合度產生影響。

總體來說，在構建的Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）SSD曲線中，從生物大類即土壤植物、動物和微生物的敏感性順序上來說，沒有表現出明顯的規律。但在Cr（Ⅵ）對各生物指標的EC50和EC10值構建的SSD曲線中（見圖4a，圖4c），小白菜根伸長指標均位于曲線的最底端，表明小白菜根伸長可作為土壤Cr（Ⅵ）對生態系統毒性的敏感指標，用于土壤Cr（Ⅵ）污染的生物監測和預警。而在Cr（Ⅲ）的SSD曲線中（圖4b，圖4d），土壤脫氫酶活性較其他指標更為敏感，可作為土壤Cr（Ⅲ）污染的早期診斷指標之一。相對于土壤植物和動物，土壤微生物酶活性受Cr毒性的影響表現出了更大的變異，在SSD曲線的上、中、下端均有分布，這可能與不同酶類執行的功能不同以及Cr與微生物種群間存在著復雜的相互作用有關。過氧化氫酶可促使H2O2分解為分子氧和水[35]；脫氫酶在有機物氧化中發揮著重要作用，可將氫由電子供體傳遞給受體[36]；纖維素酶、脲酶、芳基硫酸酯酶、堿性磷酸酶分別在土壤碳、氮、硫、磷循環中發揮著重要作用[37]。重金屬Cr可以通過抑制微生物的生長繁殖或與酶分子的巰基、氨基和羧基結合從而抑制酶的合成和活性[38]；也能夠通過選擇性富集Cr耐受菌或作為酶的輔基，從而促進酶的合成和活性[39]。微生物還可以通過溶解、吸附、沉淀和氧化還原等作用影響Cr的生物有效性，從而改變Cr對微生物及其酶活性的毒性[40-41]。

圖1 基于種間外推模型的Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的實測EC50與預測EC50（a）和實測EC10與預測EC10（b）的相關性Figure1 Correlation between measured and predicted EC50（a）and EC10（b）of Cr（Ⅵ）and Cr（Ⅲ）based on interspecies extrapolation models

圖2 歸一化前后Cr（Ⅵ）對各生物指標的EC50和EC10的種內變異Figure2 Intraspecific variation of EC50and EC10of Cr（Ⅵ）for various biological indicators before and after their normalization

圖3 歸一化前后Cr（Ⅲ）對各生物指標的EC50和EC10的種內變異Figure3 Intraspecific variation of EC50and EC10of Cr（Ⅲ）for various biological indicators before and after their normalization

本研究對SSD曲線中共有生物指標的Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）毒性進行了比較分析，見表5。根據不同價態Cr對赤子愛勝蚓產繭量的EC50和EC10值，得出Cr（Ⅵ）對赤子愛勝蚓產繭量的毒性是Cr（Ⅲ）的12.8倍和21.0倍，原因可能是：在中性pH條件下，Cr（Ⅵ）是水溶性的且較Cr（Ⅲ）離子更小，因此更容易穿透細胞膜表現出毒害，而Cr（Ⅲ）較難穿過細胞膜以及少量的Cr（Ⅲ）是動物必需的微量元素[6]。研究發現Cr（Ⅵ）對土壤脫氫酶活性、芳基硫酸酯酶活性和堿性磷酸酶活性的毒性也高于Cr（Ⅲ）6.53～41.7倍，這可能與Cr（Ⅵ）具有強氧化性、移動性強和不容易被土壤顆粒吸附等有關[42]。而對于土壤脲酶活性和過氧化氫酶活性，其Cr（Ⅲ）的毒性是Cr（Ⅵ）毒性的1.38～5.10倍，表明土壤脲酶活性和過氧化氫酶活性對Cr（Ⅲ）的毒害更敏感。由于過氧化氫酶可清除Cr（Ⅵ）等氧化劑在還原過程中形成的自由基[43]，脲酶可將尿素分解成和氨，增加土壤pH和固化重金屬，因此當存在移動性較強的Cr（Ⅵ）時，可能會進一步刺激這兩類酶的活性，以抵御重金屬對微生物的傷害[44]。

圖4 中性土壤情景下Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的SSD曲線Figure4 SSD curves of Cr（Ⅵ）and Cr（Ⅲ）in the neutral soil scenario

表5 中性土壤情景下Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）EC50與EC10的預測值Table5 Predicted values of EC50and EC10of Cr（Ⅵ）and Cr（Ⅲ）in neutral soil scenario

此外，對于同一價態的Cr來說，在由EC50和EC10數據構建的SSD曲線中，其共有指標的排列順序也是不同的，如在由Cr（Ⅵ）的EC50值構建的SSD曲線中（圖4a），土壤脫氫酶活性較芳基硫酸酯酶活性對Cr（Ⅵ）的毒害更敏感，而在Cr（Ⅵ）的EC10值構建的SSD曲線中（圖4c），土壤芳基硫酸酯酶活性較脫氫酶活性更為敏感。由于EC50和EC10值分別對應著對某個生物指標的50%和90%保護水平，因此這說明物種的敏感性順序與對各物種的保護水平有關，這也促使我們進一步分析不同保護水平下的Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）對生態系統的毒性差異。

基于在中性土壤條件下Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的SSD曲線和PAF公式（圖4），反推出了不同PAF下Cr（Ⅵ）與Cr（Ⅲ）的EC50和EC10值（見表6）及其兩種價態Cr的 EC50比值（圖 5a）和 EC10比值（圖 5b），以反映Cr（Ⅵ）與Cr（Ⅲ）的毒性差異隨生態系統保護水平的變化。當PAF較低（即較高的生態系統保護水平）時，基于EC50和EC10值得到的Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的濃度比值均小于1，表明Cr（Ⅵ）較Cr（Ⅲ）具有更高的生態毒性；隨著PAF的增大，Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的濃度比值逐漸增大，當基于EC50和EC10值構建的SSD曲線的PAF分別達到84.4%和87.3%（對應的EC50和EC10值分別為3076和642 mg·kg-1）時，Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的濃度比值為1，此時Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的生態毒性相等；此后隨著PAF和Cr濃度水平的進一步提高，Cr（Ⅲ）將較Cr（Ⅵ）具有更高的生態毒性。由此可以看出，Cr（Ⅵ）高于Cr（Ⅲ）毒性的SSD曲線的跨度遠大于Cr（Ⅲ）高于Cr（Ⅵ）毒性的SSD曲線的跨度，在較大的PAF和Cr濃度范圍內，Cr（Ⅵ）的生態毒性顯著高于Cr（Ⅲ）。由于在生態風險評價和安全性閾值制定中通常選擇95%的保護水平（即PAF為5%），在此水平下基于EC50和EC10值得到的Cr（Ⅵ）的濃度分別為10.2和0.376 mg·kg-1，而Cr（Ⅲ）的濃度分別為406 mg·kg-1和51.8 mg·kg-1，Cr（Ⅵ）的毒性分別是 Cr（Ⅲ）毒性的39.8倍和138倍，表明在通常的保護要求和污染水平下，Cr（Ⅵ）對生態系統的毒性也顯著高于Cr（Ⅲ）。

在今后對我國土壤Cr污染的生態毒性研究中，應進一步完善不同土壤類型下不同價態Cr對多種生物指標的毒理學數據庫，以建立每一生物指標與土壤性質關系的毒性預測模型，構建不同土壤情景下不同價態Cr的SSD曲線，并發展土壤外源添加Cr的淋洗和老化模型，以進一步為不同土壤情景下不同價態Cr的生態毒性差異比較和生態安全閾值的制定提供科學依據。

圖5 中性土壤情景中不同PAF下Cr（Ⅵ）與Cr（Ⅲ）的EC50比值（a）與EC10比值（b）Figure5 Ratios of Cr（Ⅵ）and Cr（Ⅲ）EC50s（a）and EC10s（b）under different PAFs in the neutral soil scenario

表6 中性土壤情景中不同PAF下Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的濃度Table6 Concentrations of Cr（Ⅵ）and Cr（Ⅲ）under different PAFs in the neutral soil scenario

3 結論

（1）根據Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）在中性土壤情景下的SSD曲線，發現小白菜根伸長和土壤脫氫酶活性分別是對土壤Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）污染最敏感的生物指標，可作為土壤Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）污染的早期生物診斷和預警的潛在指標之一。

（2）通過對Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）SSD曲線中共有生物指標的比較，發現對于不同的物種來說，Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）的毒性強弱有質的區別：對于赤子愛勝蚓產繭量、土壤脫氫酶活性、芳基硫酸酯酶活性和堿性磷酸酶活性而言，Cr（Ⅵ）具有更高的毒性；而對于土壤脲酶活性和過氧化氫酶活性來說，Cr（Ⅲ）具有更高的毒性。

（3）根據PAF的反推公式，發現在較大的PAF和Cr濃度范圍內，即基于EC50和EC10值構建的SSD曲線的PAF分別在84.4%和87.3%以下或對應的EC50和 EC10值分別低于 3076 mg·kg-1和 642 mg·kg-1時，Cr（Ⅵ）的生態毒性顯著高于Cr（Ⅲ）；在通常的保護水平（即PAF為5%）下，Cr（Ⅵ）對生態系統的毒性也顯著高于Cr（Ⅲ）。