不同產(chǎn)地青錢柳多糖的體外抗氧化及α葡萄糖苷酶抑制活性

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(貴州師范大學生命科學學院,貴州貴陽 550025)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一類以高血糖為主要特征的代謝性疾病,隨著人們生活水平的提高,糖尿病的發(fā)病率逐漸增高,嚴重威脅人類的生命健康[1]。目前,預防和治療糖尿病的藥物主要為化學降糖藥物(磺脲類、格列奈類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑等)[2],見效快,但長期服用會產(chǎn)生一定毒副作用,導致機體胰島素受體敏感性降低,甚至影響肝臟系統(tǒng)的正常運行。另外,高血糖引起的體內(nèi)氧化應激反應,致使機體內(nèi)自由基難于清除,自由基在體內(nèi)蓄積,由于含未配對的電子,所以自由基不穩(wěn)定,會從鄰近的分子(包括脂肪、蛋白質(zhì)和DNA)上奪取電子,從而處于穩(wěn)定的狀態(tài),使得機體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪和 DNA 等生物大分子受到損害,細胞結構遭到破壞,影響機體平衡[3]。自由基與機體的許多功能障礙和疾病的發(fā)生密切相關,是糖尿病并發(fā)癥產(chǎn)生的重要因素,因此,清除體內(nèi)自由基也是預防糖尿病并發(fā)癥的途徑之一[4]。故尋找更為安全、無毒副作用、經(jīng)濟的天然降血糖藥物及抗氧化劑迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同來源青錢柳樣品 均為原產(chǎn)地商家提供,經(jīng)貴州師范大學生命科學學院劉映良教授鑒定為胡桃科青錢柳屬植物青錢柳(Cyclocaryapaliurus)茶葉,樣品存放于貴州師范大學生命科學學院1509植物化學研究實驗室,樣品詳細信息(見表1);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),α-葡萄糖苷酶,對硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(PNPG) Sigma公司;葡萄糖 天津市魯鑫化工科技有限公司;抗壞血酸 青島賀陽化玻有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris) 南京化學試劑總廠;硫酸亞鐵 濟寧宏明化學試劑有限公司;30%雙氧水溶液 天津市東麗區(qū)華明街北于堡工業(yè)小區(qū);鹽酸 廣西浙創(chuàng)化工有限公司;連苯三酚 湖南洪江棓雅生物科技有限公司;水楊酸 成都聯(lián)禾化工醫(yī)藥有限責任公司;EDTA 重慶化學試劑總廠;甲醇 天津市恒興化學試劑制造有限公司;以上試劑 均為分析純。

表1 樣品來源信息Table 1 The information of sample source

UV759CRT紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;電子恒溫水浴鍋 上海宜昌儀表紗篩廠;EYELAN1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 BIOGEN倍捷科技;101-2AB型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;CXP-100型多功能粉碎機 上海市晟喜制藥機械有限公司;MS105DU型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;TD6離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;精密pH儀 上海精科雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 青錢柳多糖的提取 參照謝建華[21]的方法稍作調(diào)整,精準稱取各青錢柳樣品5.000 g,石油醚脫脂脫色2 h后,加80%乙醇溶液90 ℃水浴回流2 h,過濾揮干,濾渣加100 mL蒸餾水沸水浴提取2 h,減壓濃縮成浸膏,蒸餾水定容于25 mL容量瓶,4 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 多糖標準曲線的繪制 以葡萄糖為標準品,精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標準品 105 mg,蒸餾水定容于100 mL容量瓶中,配制成1.05 mg/mL的葡萄糖標準溶液。精密吸取0、1、2、4、6、8、10 mL于100 mL容量瓶中,蒸餾水定容,分別取2 mL于具塞試管中,加入5%的標準苯酚溶液 1.0 mL,混勻,迅速加入濃硫酸 5.0 mL,搖勻,放入沸水浴中加熱20 min,取出自來水冷卻至室溫,于488 nm 處測定吸光度,2 mL蒸餾水重復以上操作為對照,以多糖濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線,得出曲線方程:Y=14.642X-0.0768,R2=0.999。

1.2.3 多糖含量測定 精密量取各多糖提取液,稀釋至實驗所需濃度,按照 1.2.2方法測定,按下式計算樣品中多糖含量。

式中:C:由回歸方程得出的多糖濃度(mg/mL);N:稀釋因數(shù)(mL);M:多糖提取物的質(zhì)量(mg)。

1.2.4 DPPH·自由基清除能力的測定 參照文獻[22],精密吸取 2.0 mL DPPH·甲醇溶液(0.068 mg/mL)與 2.0 mL甲醇溶液混合,暗室放置30 min,于517 nm測量吸光值(A1),以2.0 mL不同濃度(0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL)多糖或VC,與等體積甲醇溶液混合,暗室放置30 min,于517 nm測量吸光值(A2),以2.0 mL不同濃度多糖或 VC溶液,與等體積的 DPPH·甲醇溶液混合,暗室放置30 min,于517 nm測量吸光值(A3)。

1.2.5 ·OH自由基清除能力的測定 參照文獻[23],依次向試管中加入2.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液,2.0 mL不同濃度的多糖或VC溶液,2.0 mL 6 mmol/L雙氧水溶液,搖勻,靜置10 min后,再加入等體積6 mmol/L水楊酸溶液,混勻,靜置 30 min,于510 nm處測定吸光值A樣品,以蒸餾水代替水楊酸溶液,測定A對照,以蒸餾水代替多糖溶液,測定A空白。

1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 參照文獻[25]的方法略調(diào)整,樣品項:以PNPG為底物,取0.2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)于試管中,加入0.2 mL各多糖提取液,搖勻,再加入0.2 mL 0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液,在37 ℃恒溫水浴鍋中反應15 min后加5 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液終止反應,在400 nm處測定吸光值A樣。空白項:以PNPG為底物,取0.2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)于試管中,加入0.2 mL 0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液,在37 ℃恒溫水浴鍋中反應15 min后,加5.0 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液終止反應,在400 nm處測定吸光值A空。背景項:以PNPG為底物,取0.2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)于試管中,加入0.2 mL各多糖提取液,在37 ℃恒溫水浴鍋中反應15 min后,加5.0 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液終止反應,在400 nm處測定吸光值A背。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均按照對應的公式計算,平行測定三次(n=3),所得結果以平均值±標準誤表示,分別采用 Excel、Origin 9.0 和SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)列表作圖。不同小寫字母表示不同產(chǎn)地之間在0.05水平存在顯著差異,*表示在0.05水平上顯著相關。

2 結果與分析

2.1 不同產(chǎn)地青錢柳的多糖含量及差異性

由表2可知,各產(chǎn)地青錢柳多糖含量介于(3.50%±0.10%)～(5.85%±0.02%),其中,江西修水縣含量最高,為5.85%±0.02%,湖南綏寧黃桑坪鄉(xiāng)次之,為5.48%±0.10%,貴州榕江縣平陽鄉(xiāng)最低,為3.50%±0.10%,不同產(chǎn)地之間青錢柳多糖含量存在顯著差異(p<0.05)。分析其原因可能是“性從地變,質(zhì)與物遷”,不同產(chǎn)地因地理環(huán)境、氣候條件、生態(tài)系統(tǒng)等因素的差異,導致不同地區(qū)青錢柳多糖含量存在較大差異。

表2 不同產(chǎn)地青錢柳多糖含量Table 2 The content of Cyclocarya paliuruspolysaccharides from different regions

2.2 青錢柳多糖對DPPH·的清除能力

不同產(chǎn)地青錢柳多糖對DPPH·的清除能力如圖1所示。研究結果表明,在0.01～2.0 mg/mL實驗濃度范圍內(nèi),青錢柳多糖對DPPH·具有一定的清除能力,且清除率隨多糖濃度的增大而增大,呈一定量效關系。當多糖濃度大于0.1 mg/mL時,清除率高于80%,清除能力與VC相當,當多糖濃度低于0.1 mg/mL時,清除率略低于VC。各產(chǎn)地青錢柳多糖對DPPH·清除能力的差異不明顯。

圖1 青錢柳多糖對DPPH·清除能力Fig.1 Scavenging ability against DPPH ofCyclocarya paliurus polysaccharides

2.3 青錢柳多糖對·OH清除能力

不同產(chǎn)地青錢柳多糖對·OH清除能力如圖2所示。圖2表明,在0.01～2.0 mg/mL實驗濃度范圍內(nèi),青錢柳多糖對·OH具有一定的清除能力,且隨著濃度的增加,清除率也隨之增加,呈一定量效關系。但整體而言,青錢柳多糖對·OH的清除率都弱于VC,不同產(chǎn)地青錢柳多糖對·OH的清除能力差異不明顯。

圖2 青錢柳多糖對·OH的清除能力Fig.2 Scavenging ability against ·OH of Cyclocarya paliurus polysaccharides

2.4 青錢柳多糖對清除能力

圖3 青錢柳多糖對的清除能力Fig.3 Scavenging ability of Cyclocarya paliurus polysaccharides control against

2.5 青錢柳多糖對α-葡萄糖苷酶抑制能力

不同產(chǎn)地青錢柳多糖對α-葡萄糖苷酶抑制能力如圖4所示。圖4表明,在實驗濃度范圍內(nèi),青錢柳多糖對α-葡萄糖苷酶具有一定抑制能力,且隨著濃度的增加,抑制能力增強。其中,江西修水縣城的青錢柳多糖抑制α-葡萄糖苷酶能力優(yōu)于對照品阿卡波糖的抑制能力,其余產(chǎn)地樣品抑制率均低于阿卡波糖抑制能力。

圖4 青錢柳多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.4 Inhibiting ability of Cyclocarya paliurus polysaccharides control against alpha glucosidase

2.6 青錢柳多糖對各模型的IC50值及相關性分析

表3 青錢柳多糖對各模型的IC50值Table 3 The IC50value of Cyclocarya paliurus polysaccharide to each model

3 結論