腌制處理對養殖大黃魚品質的影響

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(1.浙江萬里學院生物與環境學院,浙江寧波 315100;2.寧波市檢驗檢疫研究院,浙江寧波 315012;3.寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是我國傳統“四大海產”之首,是浙江沿海特色珍貴經濟魚類。在上世紀80年代,毀滅性捕撈導致野生大黃魚幾乎滅絕。為了改變這一現狀,水產科技工作者開始研究大黃魚的人工繁育和養殖技術,并于1985 年首次成功人工培育了大黃魚魚苗。隨著育苗技術和養殖技術的不斷成熟,養殖大黃魚的產量逐年增加,現已成為我國八大優勢出口養殖水產品之一,更是我國養殖規模最大的海水魚類[1]。它具有營養豐富、味道鮮美、低脂肪、高蛋白等優點,是膳食平衡中不可或缺的重要組分,深受國內外消費者的喜愛[2]。養殖大黃魚蛋白質含有多種氨基酸,且組成與人體組織蛋白相近,有較高的營養價值[3]。

養殖大黃魚以鮮銷為主,但養殖大黃魚水分含量高、腐敗菌組成復雜,不易保存[4],故有部分養殖大黃魚去內臟后洗清,鹽漬曬干制成“黃魚鲞”或制成魚罐頭[5]。腌制食品作為傳統風味產品,具有廣大的消費群體,研究腌制處理對養殖大黃魚的品質影響及作用機理對保證腌制食品安全、推廣腌制食品市場將有主要意義。

腌制處理對魚肉的口感、風味、營養成分等均有較大影響,特別是對其蛋白質變性具有較大影響[6],但目前對腌制處理的養殖大黃魚研究主要集中在鮮度、營養成分及微生物菌群等方面,而在腌制處理對蛋白質的影響研究較少。本文通過鹽漬處理養殖大黃魚,分析其鮮度、蛋白特性、組織結構的變化及相互聯系,為養殖大黃魚的腌制工藝以及新產品的開發提供理論依據,有利于促進養殖大黃魚加工產業化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮養殖大黃魚 體長(30±3) cm,體重(0.5±0.1) kg,寧波路林市場,用冰盒運回實驗室;氯化鈉(≥99.5%)、磷酸二氫鉀(≥99.5%)、磷酸氫二鉀(≥99.5%)、硫代巴比妥酸(≥99.5%)、甲基紅(≥99.5%)、溴甲酚綠(≥99.5%)、硼酸(≥99.5%)、高氯酸(≥99.5%)、硫酸銅(≥99.5%)、酒石酸鉀鈉(≥99.5%)、溴酚藍(≥99.5%)、乙酸乙酯(≥99.5%)、鹽酸胍(≥99.5%)、二硝基苯腙(≥99.5%) 均為分析純(AR),國藥集團化學試劑有限公司;超微量Ca2+-ATPase酶試劑盒、微量總巰基測試盒 南京建成生物工程研究所。

PL2002電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Forma-725超低溫冰箱 澳柯瑪股份有限公司;centrifuge 5804R離心機 德國Eppendorf 5804R;YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;HWS型恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器廠;7230G可見光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SKD-1000自動凱氏定氮儀 上海天齊生物科技有限公司;e2695高效液相色譜儀 上海瑞玢國際貿易有限公司;FE20pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DK-8D恒溫水浴鍋 上海維誠儀器有限公司;BCD-216ZDJ可調式冰箱 青島海爾股份有限公司;HWS-160恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器廠;Universal TA物性分析儀 上海騰拔儀器科技有限公司;UV2000紫外分光儀 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;131EVO差示掃描微量熱儀 法國塞塔拉姆;MS-PB磁力攪拌器 上海圣科儀器設備有限公司;LGJ-10真空冷凍干燥機 上海實維實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 養殖大黃魚的腌制 養殖大黃魚處理:去頭、去尾、去鱗、去皮、去內臟,剖成兩片,取背部肌肉,切成3 cm×3cm×1 cm大小塊狀,隨機將樣品分為兩組,一組為空白對照組,另一組作為腌制組,將腌制組置于料液比3∶1的飽和食鹽水中進行腌制[7],腌制溫度為19 ℃,腌制時間為5 min。將兩組樣品置于4 ℃冰箱中放置24 h后待用。

1.2.2 肌原纖維蛋白的提取 參照Jiang[8]和Chin[9]的研究,稍作修改。取適量魚肉,加4倍體積4 ℃預冷的提取液(20 mmol/L,pH7.5磷酸緩沖液),高速勻漿機7500 r/min勻漿60 s,7000 r/min冷凍離心10 min,去上清,重復勻漿離心兩次,粗肌原纖維蛋白(MPI)勻漿60 s,4倍體積冰洗液(0.1 mol/L NaCl 溶液)7000 r/min冷凍離心10 min,去上清,重復勻漿離心一次。粗MPI勻漿60 s,4倍體積4 ℃預冷的3層紗布過濾,7000 r/min冷凍離心10 min,沉淀MPI后待用,用于Ca2+-ATPase、持水性、巰基、表面疏水性、羰基的測定。

1.2.3 pH的測定 取魚肉樣品10 g,參照GB 5009.237-2016食品pH的測定[10]進行檢測

1.2.4 揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定 取魚肉樣品5 g,參照GB4789.2-2016食品中揮發性鹽基氮的測定[11]進行檢測。

1.2.5 K值(品鮮度)的測定 參照SC/T3048-2014魚類鮮度指標K值的測定高效液相色譜法[12]進行測定。稱取魚肉樣品(2±0.02) g于燒杯,均質后放入離心管內,加人20 mL 10%(v/v)高氯酸溶液,振蕩1 min,然后在4 ℃,8000 r/min離心10 min,取出上清液。再用10 mL 5%(v/v)高氯酸溶液提取沉淀物中的待測物,4 ℃,8000 r/min離心10 min。重復操作一次,合并上清液。用10 mol/L的氫氧化鈉溶液調節提取液pH至近6.0,然后再用1 mol/L的氫氧化鈉溶液繼續調節pH至6.0～6.4。將已調節pH后的溶液轉移至50 mL容量瓶中,用4 ℃水定容。將定容后的溶液4 ℃,8000 r/min離心10 min,然后用0.22 μm微孔濾膜過濾,最后將濾液放入高效液相色譜儀檢測。按照以下公式計算K值。

K(%)=(WHxR+WHx)/(WATP+WADP+WAMP+WIMP+WHxR+WHx)×100

式中:WATP-樣品中腺苷三磷酸的含量,μmol/g;WADP-樣品中腺苷二磷酸的含量,μmol/g;WAMP-樣品中腺苷酸的含量,μmol/g;WIMP-樣品中肌苷酸的含量,μmol/g;WHxR-樣品中次黃嘌呤核苷的含量,μmol/g;WHx-樣品中黃嘌呤的含量,μmol/g。

1.2.6 菌落總數的測定 取魚肉樣品5 g,參照GB/T4789.2-2016食品微生物學檢測-菌落總數[13]測定進行檢測。

1.2.7 硫代巴比妥酸值(TBA)的測定 參照魯珺[14]的方法,各取5 g魚肉樣品研碎,加入25 mL 7.5%的三氯乙酸(含有0.1% EDTA),振蕩搖勻,靜置30 min后用雙層濾紙過濾2次。取5 mL上清液于離心管內,加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液,放入沸水浴40 min后取出冷卻1 h,10000 r/min離心25 min,取清液于試管內,加入5 mL氯仿搖勻,靜置分層后取上清液分別在532 nm和600 nm波長處比色,并用以下公式計算值。

式中:A532為樣品在532 nm下的吸光值;A600為樣品在600 nm下的吸光值。

1.2.8 質構的測定 參考楊華[2]的方法,取3 cm×3 cm×1 cm塊狀魚肉樣品,定時質構儀探頭型號P/100,測試速率:1 mm/s;測試速率:0.5 mm/s;測試后速率:0.5 mm/s;壓縮比:50%;探頭2 次測定間隔時間:5 s;觸發力 5.0 g;觸發類型:自動。測試前將樣品置于4 ℃冰箱平衡1 h,每組品測定3次。

1.2.9 肌原纖維蛋白濃度測定 雙縮脲法測定蛋白質質量濃度[15]。取1 mL肌原纖維蛋白溶液,加入4 mL雙縮脲試劑,25 ℃水浴30 min,在波長540 nm處測吸光度。對照標準曲線求肌原纖維蛋白的質量濃度。

1.2.10 Ca2+-ATPase的測定 使用超微量Ca2+-ATP酶測試盒對魚肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase進行測定。

1.2.11 持水性測定 參考李強[16]的實驗方法,做修改。取0.1 g(精確到0.0001 g)肌原纖維蛋白樣品,加水至漿狀,漩渦混勻,28 ℃放置30 min,3500 r/min離心15 min,倒出離心管多余水分,稱取蛋白糊質量,每個樣品測定三次。

式中:m0為離心管重,g;m1為試管樣品總重,g;m2為離心前試管樣品重,g;m3為離心后去水試管樣品重,g。

1.2.12 巰基的測定 取肌原纖維蛋白樣品,使用巰基試劑盒對肌原纖維蛋白巰基進行測定。

1.2.13 表面疏水性測定 參照Chelh[17]的方法,取肌原纖維蛋白溶于20 mmol/L pH6.0的磷酸緩沖液中,使樣品蛋白濃度為5 mg/mL。取200 μL 1 mg/mL的溴酚藍溶液到1 mL的MP溶液中,混勻,室溫下磁力攪拌器攪拌10 min,然后7500 r/min常溫離心15 min,取1 mL上清液溶于9 mL 20 mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液中,在595 nm下測定吸收值A1。以磷酸鹽緩沖液作空白樣吸光值記做A0,結果以“平均值±標準偏差”表示。表面疏水性用以下公式表示:

式中:A0為磷酸鹽緩沖液在595 nm下的吸光值;A1為樣品在595 nm下的吸光值。

1.2.14 羰基測定 參考李學鵬[18]的方法,取1 mL蛋白溶液(濃度為5 mg/mL)放入塑料離心管并加入1 mL DNPH溶液(10 mmol/L含2 mol/L HCI),室溫條件下避光靜置1 h(每15 min,振蕩一次),添加3 mL 20%的TCA后10000 r/min離心5 min,棄上清液,用乙酸乙酯-乙醇(體積比1∶1)清洗沉淀3次后,加入6 mol/L鹽酸胍溶液5 mL,37 ℃保溫15 min使沉淀溶解,10000 r/min離心3 min去除不溶物,所得溶液于370 nm波長下測定吸光度。使用分子吸光系數22000 L/(mol·cm)計算每mg蛋白中羰基含量。

A=εbc

式中:A為吸光度;ε為摩爾吸光系數,L/(mol·cm);b為吸收池光程長,cm;c為吸光物質的濃度,mol/L。

1.2.15 差示掃描微量熱(DSC)測定 采用差示掃描微量熱儀(DSC)進行測定[19],在鋁坩堝中放入一定量(0.2～0.5 mg)的不同處理樣品的肌原纖維蛋白,測定其DSC曲線。溫度掃描范圍:15～150 ℃;掃描速率:5 ℃/min。

1.3 數據處理

使用SPSS Statistics 17軟件進行差異性顯著分析,使用Office Excel 2003軟件進行數據處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 腌制處理對養殖大黃魚魚肉生化保鮮品質的影響

pH、TVB-N、K值、菌落總數和TBA均為水產品鮮度評價的重要指標。水產品在死亡之后,體內的糖原開始發生糖酵解,反應產生乳酸、丙酮酸、磷酸等酸性物質導致pH下降[20],如表1所示,養殖大黃魚經腌制處理,pH相對于對照組有所下降,但降低不顯著(p>0.05),說明腌制處理會促進養殖大黃魚體內糖原的分解,腌制魚肉的風味變化可能與其體內的糖原分解及乳酸含量有關。

表1 腌制處理對魚肉生化保鮮品質的影響Table 1 The effect of pickling treatment on the biochemical preservation quality of fish meat

水產品在腐敗過程中,由于細菌的生長繁殖和酶的氧化分解作用,使蛋白質分解而產生氨及胺類及氨等堿性含氮物質,具有揮發性。剛剛屠宰的魚肉中TVB-N含量一般維持在20 mg/100 g以下,當魚肉中的TVB-N 含量達到或者超過30～35 mg/100 g時,樣品已到達冷藏魚類的感官接受極限[21]。如表1所示,腌制組TVB-N含量顯著高于對照組(p<0.05),原因可能是魚肉經腌制處理,鹽度增加促進了魚肉中蛋白質的分解,導致TVB-N含量增加,但與對照組仍在新鮮范圍之內。

水產品在死后初期ATP即開始分解成AMP、ADP、HxR、IMP、Hx等。行業標準規定新鮮宰殺的魚類K值在10%以下,K值在 20%以下為一級鮮度,20%～40%為二級鮮度,60%以下為可供一般食用與加工,60%～80%為初期腐敗[22]。如表1所示,相比于對照組,經腌制處理的魚肉K值增加不顯著(p>0.05)。腌制處理在一定程度上促進了魚肉中ATP的分解,導致K值增加,但腌制后的養殖大黃魚仍屬于屬于一級鮮度。

菌落總數測定是用來判定食品被細菌污染的程度及衛生質量,它反映食品在生產過程中是否符合衛生要求,以便對被檢樣品做出適當的衛生學評價。菌落總數的多少在一定程度上標志著食品衛生質量的優劣[23-24]。如表1所示,對照組菌落總數為(4.48±0.38) lg cfu/g,腌制組菌落總數為(3.97±0.21) lg cfu/g,經腌制處理,魚肉中鹽度增加,滲透壓發生改變,對魚肉中部分微生物具有抑制、殺滅作用。腌制組的菌落總數低于對照組的菌落總數。

TBA值是判斷脂肪氧化的重要指標。脂肪氧化和水解產生的酮類和醛類物質是引起魚肉品質劣變的重要原因之一[25]。養殖大黃魚是一種高蛋白高脂肪的魚類,且其脂肪酸大多為不飽和脂肪酸,極易與空氣中的氧氣發生氧化反應產生氧化降解產物丙二醛。如表1所示,對照組TBA值為(0.25±0.04) mg/100 g,腌制組TBA值為(0.57±0.02) mg/100 g,腌制組TBA值顯著(p<0.05)高于對照組,說明腌制處理促進了大黃魚肉脂肪的氧化,游離脂肪酸的滲出。

通過上述分析可得,腌制處理在一定程度上促進養殖大黃魚肉糖原降解、脂肪氧化,保鮮品質有所下降,但都屬于新鮮的范圍,且腌制處理可以殺滅微生物、抑制微生物的生長,使腌制品能夠長期保藏。

2.2 腌制對養殖大黃魚質構的影響與分析

如表2所示,魚肉經腌制處理,大黃魚肉硬度、粘聚性、彈性均低于對照組,硬度和彈性均顯著降低(p<0.05),粘聚性降低不顯著(p>0.05)。原因可能是在腌制過程中,鹽處理對魚肉的組織結構有所影響,改變了魚肉中的水分含量及水分活度,而鹽對魚肉中肌原纖維蛋白的變性可能有影響,氯化鈉可能改變了蛋白的水合作用[6],導致其質構發生了改變,從而對魚肉的品質產生影響,故而影響了腌制食品的口感等。

表2 不同處理方式對魚肉質構的影響Table 2 Effect of different treatments on the texture of fish

2.3 腌制對養殖大黃魚肌原纖維蛋白特性的影響

養殖大黃魚經相同方式提取肌原纖維蛋白,腌制組的肌原纖維蛋白含量顯著高于(p<0.05)對照組,肌原纖維蛋白為鹽溶性蛋白[26],魚肉經腌制處理可能有利于提高其肌原纖維蛋白的提取率;或腌制處理影響了其它蛋白的提取,致使腌制組肌原纖維蛋白含量增加。鹽度使得肌肉纖維解開,提高纖維蛋白的得率。

蛋白質溶液中,蛋白分子之間的相互作用和蛋白分子與水分子之間的相互作用直接影響蛋白質分子的空間結構,影響蛋白分子功能性質的穩定性。蛋白質表面疏水性可以說明蛋白質分子內部疏水基團的暴露程度[27]。表面疏水基團暴露的越多,肌原纖維蛋白的表面疏水性越大,肌原纖維蛋白分子有機會發生聚合,最終導致蛋白質分子不可逆的變性。如表3所示,腌制組表面疏水性顯著低于(p<0.05)對照組,可能是因為肌原纖維蛋白是鹽溶性蛋白,在一定離子強度的鹽溶液中,肌原纖維蛋白溶解性有所增強。

表3 不同處理方式對蛋白特性的影響Table 3 Effect of different treatments on the the protein characteristics

魚體中存在的肌球蛋白與肌動蛋白在ATP作用下生成肌動球蛋白,而肌球蛋白的重要生物活性之一就是具有Ca2+-ATPase活性。活性反映肌球蛋白頭部性質的變化,是魚肉在冷藏過程中蛋白質性質的一個重要指標,其活性值越高,說明蛋白質性質越穩定,冷凍變性程度越小,品質也越好[28]。如表3所示,腌制組Ca2+-ATPase活性顯著低于(p<0.05)對照組,引起Ca2+-ATPase活性下降的原因是多方面的,可能與腌制處理導致養殖大黃魚肌球蛋白解旋開來以及魚肉pH的下降、巰基氧化等導致活性導致Ca2+-ATPase活性下降。

持水性可以反映蛋白網絡結構,凝膠結構越細密、均勻,持水性越好[28]。在魚糜凝膠網絡結構形成過程中,鍵、疏水和靜電相互作用等影響著凝膠網絡結構。肌原纖維蛋白也會直接和水相互作用產生毛細現象,與持水性密切相關。如表3所示,腌制組的持水性顯著低于(p<0.05)對照組,因為鹽濃度的增大,肌原纖維蛋白發生了變性,凝膠結構不穩定,持水性下降。

蛋白質結構的變化是巰基形成二硫鍵,巰基含量是蛋白結構改變的一個重要指標。巰基是魚肉中反應活性最強的功能性基團。腌制處理可能會使蛋白質降解、解聚及重聚合,蛋白質內的游離巰基含量也會隨之改變,如巰基形成二硫鍵。所以巰基含量在一定程度上可以反應腌制處理對養殖大黃魚肉肌原纖維蛋白的變性程度[29]。如表3所示,腌制組巰基含量顯著高于(p<0.05)對照組,推測原因可能是由于腌制過程中蛋白質分子空間結構折疊打開暴露更多的巰基基團,分子內部疏基的氧化程度很低導致總巰基含量略微的上升。

羰基的形成是蛋白質氧化后最顯著的變化之一,因此羰基含量已經成為衡量蛋白質氧化程度常用指標[30]。如表3所示,腌制組羰基含量顯著低于(p<0.05)對照組,腌制組氧化程度低于對照組,說明腌制處理在一定程度上可以延遲蛋白的羰基化,減慢蛋白的氧化。

高濃度的鹽溶液會引起肌原纖維蛋白的變性,蛋白質發生變性其熱焓也會發生變化,采用差示掃描量熱儀(DSC)進行分析[27],DSC曲線中的吸收峰表示蛋白熱量被吸收,也是蛋白質的熱變性的過程,目標蛋白會呈現固定的吸收峰;峰值的變化、變性溫度的位移和消失可反映蛋白的變性情況,由此可根據DSC圖譜的變化推測蛋白構象的變化,進而得到腌制處理后肌原纖維蛋白結構的穩定性。如圖1所示,為腌制處理對養殖大黃魚肌原纖維蛋白的DSC曲線,經腌制處理后的的熱焓高于未處理組樣品,腌制組在36、100 ℃時出現吸收峰,而對照組在115 ℃出現吸收峰,說明腌制處理降低了肌原纖維蛋白的熱穩定性,腌制處理破壞肌原纖維蛋白構象,導致變性溫度降低。

3 結論與討論

結果表明腌制處理在一定程度上降低了養殖大黃魚鮮度和組織結構,腌制過程中大量鹽溶液滲透到魚肉中,改變其滲透壓,可能對魚肉細胞膜及細胞結構有所影響,從而加速了蛋白質、ATP等的分解,使魚肉品質發生變化;但滲透壓的改變,也對魚肉中微生物有所抑制,在一定程度又有利于魚肉的保藏;同時腌制處理改變了魚肉的質構、水分、鹽分等,水分上升、鹽分增加,質構相關指標均有所降低,改變其口感[31];而飽和食鹽水腌制處理可以促進養殖大黃魚肌原纖維蛋白的提取率;腌制處理對蛋白結構的影響體現在改變了肌原纖維蛋白的熱穩定性,使其發生了結構上的變性;而腌制處理使肌原纖維蛋白的持水性和表面疏水性均下降,說明了腌制處理破壞了肌原纖維蛋白間的空間結構,同時腌制處理對肌原纖維蛋白的巰基、羰基和Ca2+-ATPase均有影響,而巰基、羰基和Ca2+-ATPase在一定程度又可以反映蛋白質的品質情況,腌制處理促使養殖大黃魚肌原纖維蛋白發生變性,進而影響其魚肉的口感及風味。

現階段,國內外在鹽處理對蛋白質變性機理上日益增多[32-33],多體現在變性情況及功能影響上,腌制處理對養殖大黃魚蛋白質的特性及結構的影響有待更深層的研究。通過這些方面的研究為養殖大黃魚腌制工藝的商業化提供一定的理論依據。