丁香非油類成分對LDL的氧化修飾抑制作用

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(1.九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000;2.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332000;3.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇省農產品物理加工重點實驗室,江蘇鎮(zhèn)江 212013;4.江西農業(yè)大學食品科學與工程學院,江西省天然產物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045)

低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)屬于極低密度脂蛋白的代謝產物,在體內的主要功能是在肝臟和外周組織之間運輸甘油三酯和膽固醇[1]。LDL主要由脂質(74%～79%)及蛋白apoB100(21%～26%)組成[2]。LDL富含大量不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs),極易發(fā)生氧化修飾,其氧化修飾是形成動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)的關鍵,另外,過渡金屬離子銅會啟動脂質過氧化鏈式反應,加劇低密度脂蛋白氧化[3-4]。

丁香,為桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThunb)的干燥花蕾,又稱公丁香,丁香在國家公布的藥食兩用原料中抗氧化能力名列第一[5],主要含多酚、鞣質、黃酮及精油等[6]。丁香具有抗癌、抗氧化、抗衰老、抗菌、消炎和促進透皮吸收等作用,也是常用的調味料[2]。根據極性及溶解性特征,本實驗將丁香小分子有效成分劃分為丁香油和丁香非油類成分(The non-oil components of clove,NCC),其中,丁香油含量約占15%～20%,其內較多的功能活性已被開發(fā)研究[7-9],而對丁香除油類成分之外非油類成分的相關功能性活性也相繼被發(fā)現。沈勇根等[6]發(fā)現丁香非油類成分具有很強的抗氧化活性。Hemalatha等[10]采用丙酮、氯仿或甲醇等不同溶劑提取丁香非油類成分,發(fā)現甲醇提取物抑制DPPH自由基清除活性最強。Jin等[11]發(fā)現,丁香水提物(10 μg/mL)對LDL氧化具有較強抑制作用。目前,對NCC的研究僅限于一級有機溶劑的萃取分離,采用按照極性依次增強的有機溶劑萃取分級制備NCC的研究卻尚未見報道。

熒光光譜分析法具有操作簡單、靈敏度高、選擇性及功能性多等優(yōu)點[12],被廣泛運用于各種蛋白熒光特性的表征[13]。LDL在氧化過程中其所含脂類及蛋白均會產生修飾而改變其結構及熒光光譜性質[14-15]。實驗室前期研究發(fā)現，丁香乙酸乙酯相對LDL所含蛋白及脂類在氧化修飾過程中的熒光強度淬滅有減緩作用。但是,NCC各極性相對LDL所含蛋白及脂類在氧化修飾過程中熒光特性的影響、相互之間抑制能力的差異還尚不清楚。

因此,本文根據極性從小到大將NCC劃分為乙酸乙酯相(Ethyl acetate fraction,EAF)、正丁醇相(N-butyl alcohol fraction,NAF)和水相(Water fraction,WF),建立LDL-CuSO4氧化孵育體系,通過對Lys游離氨基活性、硫代巴妥酸反應物(Thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)含量、熒光光譜及三維熒光的測定,確定NCC中抑制LDL氧化修飾能力最強的極性成分,并考察其量效關系,以便確定NCC中抑制LDL氧化修飾的功能活性所對應的有效成分,以利于后續(xù)分離、純化、結構鑒定等研究,促進丁香抗LDL氧化及抗AS功能食品的研發(fā)進程。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丁香 生產日期:2015年10月25號,批號:1510007,購自江西黃慶仁棧華氏大藥房,由江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司分裝,產地廣西,材料買回后用高速粉碎機粉碎，過40目篩后放置冰箱中備用;低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL) 從血站取回健康人的血清,血清通過肝素鈉沉淀法[1-2]制備得到LDL,放冰箱備用;肝素鈉(185 U/mg) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;2-硫代巴比妥酸(2-Thiobarbituric acid,TBA) 國藥集團化學試劑有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-TrinitrobenzenesuLfonic acid solution,TNBS) 成都格雷西亞化學技術有限公司;其余試劑 均為國產分析純或優(yōu)級純。

LS-55型熒光/磷光/發(fā)光分光光度計 美國Perkin Elmer公司;TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計 北京譜析通用儀器有限責任公司;DFY-C型高速粉碎機 溫嶺林大機械公司;PB-10型pH計 Sartorius儀器設備有限公司;CT15RT型高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設備工程有限公司;RE-52型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 低密度脂蛋白的制備 采用文獻[1]方法,略有修改。取血漿300 mL,按體積比1∶10倒入沉淀液3000 mL(50000 U/L肝素鈉,0.064 mol/L檸檬酸三鈉,5 mol/L鹽酸調pH至5.04)中混合均勻,磁力攪拌30 s,37 ℃水浴15 min后于4 ℃,3000×g離心10 min,棄上清液。用1500 mL洗滌液(0.064 mol/L檸檬酸鈉,pH為5.11)洗滌沉淀,于4 ℃,3000×g再次離心10 min,棄上清液,沉淀物用高鹽磷酸鹽緩沖液PBS(酸液:160 g/L NaCl、10 mmol/L KH2PO4、2.7 mmol/L KCl;堿液:160 g/L NaCl、10 mmol/L Na2HPO4·12H2O,2.7 mmol/L KCl;用酸液調堿液pH為7.40,即得PBS。)重新溶解,溶解液用再生纖維素透析袋(透析截留分子量50 kDa)于4 ℃、避光透析24 h,每6 h更換一次透析液,后即得LDL溶液,待測。以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)為標品,采用Lowry’s法[1]測蛋白濃度以計算和配制LDL成相應濃度供測定。

1.2.2 有機溶劑萃取法分離制備NCC NCC各極性部位采用江慎華等[16]方法,略有修改。稱取粉碎過40目篩的丁香粉100.00 g,按料液比1∶7 (g/mL)加入甲醇,水浴振蕩提取3次,溫度25 ℃,每次120 min,提取液合并、濃縮后,加入適量去離子水混懸后,首先采用正己烷充分萃取10次以除去丁香油。剩余部分采用極性依次增大的乙酸乙酯和正丁醇依次萃取10次,最后剩余為水相,這3個萃取相真空濃縮、冷凍干燥后依次得到EAF、NAF和WF粉末,放置在真空干燥器中保存、備用。按以下公式[5]計算得率:

得率(%)=[提取物質量(g)/提取所用丁香的質量(g)]×100

1.2.3 NCC抑制LDL的氧化修飾 以下實驗中,空白組:分別以相同體積去離子水和甲醇代替CuSO4和NCC各極性相樣液;促氧組:以相同體積甲醇代替NCC各極性相樣液;樣品組:添加CuSO4和NCC各極性相樣液;對照組:添加CuSO4和BHT,其它操作均相同。本文各溶液濃度均指其在混合體系中終濃度。

1.2.3.1 NCC抑制LDL中脂類成分的氧化修飾 采用江慎華等[16]方法,稍作修改。取LDL溶液(3.2 mg/mL)400 μL,加入50 μL 3 mmol/L的CuSO4,加50 μL 30 μg/mL的NCC各相樣液及二丁基羥基甲苯(BHT),37 ℃孵育24 h后,加25 μL、1%的EDTA-Na2終止其氧化,再加入15%三氯乙酸(沉淀蛋白質)和0.67%硫代巴比妥酸(TBA)(顯色)各1 mL,充分混勻、沸水浴35 min后快速冷卻至室溫,5000×g離心10 min,取上清液于532 nm測TBARS(TBA反應產物)的OD值,確定LDL脂質氧化程度。

1.2.3.2 NCC抑制LDL中蛋白組分的氧化修飾 熒光定量比較抑制色氨酸(Trp)熒光淬滅效果:運用Chen等[17]方法,稍作修改。取4.9 mL LDL溶液(500 μg/mL),加50 μL甲醇,空白組和促氧組再加入50 μL去離子水或CuSO4(1.25 μmol/L),實驗組加入NCC各極性相樣液(EAF、NAF、WF),對照組添加BHT(濃度均為5 μg/mL,體積為50 μL),于37 ℃孵育48 h,每次取適量于Ex295/Em330 nm檢測熒光強度。

熒光掃描比較抑制色氨酸(Trp)熒光淬滅效果:運用余丹丹等[18]方法,稍作修改。參照以上方法孵育,固定Ex 280 nm、掃描Em 300～450 nm。

保護Lys游離氨基活性的研究:運用Yang等[1]方法,略作修改。取4.9 mL LDL溶液(750 μg/mL),加50 μL CuSO4(5 μmol/L)或去離子水,加50 μL NCC各相樣液或BHT(25 μg/mL),37 ℃恒溫孵育氧化48 h后,取1 mL該體系混合液與1 mL 4% NaHCO3(pH8.40)混勻后加50 mL、0.1% TNBS,37 ℃孵育1 h后在340 nm處測定吸光度值。

抑制活性醛修飾Lys的比較:運用Picard等[19]方法,稍作修改。參照1.2.3.2熒光定量比較抑制色氨酸(Trp)熒光淬滅效果方法孵育,固定Ex 350 nm,掃描Em 400～550 nm。

1.2.3.3 NCC對總熒光產物產生的抑制效果 采用Cominacini等[20]方法,稍作修改。參照1.2.3.2熒光定量比較抑制色氨酸(Trp)熒光淬滅效果方法孵育,在Ex 360/Em430 nm處檢測熒光強度。

1.2.3.4 NCC對脂褐素生成的抑制效果 采用Itakura等[15]和王麗麗等[21]方法,稍作修改。參照1.2.3.2熒光定量比較抑制色氨酸(Trp)熒光淬滅效果方法孵育,在Ex350/Em460 nm處檢測熒光強度。

1.2.4 NCC中有效部位——EAF抑制LDL氧化修飾的量效關系測定

1.2.4.1 采用熒光光譜分析EAF對LDL的氧化修飾 采用1.2.3.2和1.2.3.3方法對EAF(5、10和15 μg/mL)抑制Trp熒光淬滅、活性醛修飾Lys和總熒光產物生成的量效關系進行分析和測定。

1.2.4.2 采用三維熒光光譜分析EAF對LDL的氧化修飾 采用Koller等[14]方法,略有修改。參照1.2.4.1方法孵育反應體系,采用Ex 200～420 nm、Em 260～500 nm對體系進行三維熒光光譜掃描以反映EAF抑制LDL氧化修飾效果。

1.3 數據處理

所有實驗均為3次重復后求平均值,采用DPS 7.05軟件進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 有機溶劑萃取法分離制備NCC

采用有機溶劑萃取法分離制備丁香中的NCC,各成分得率如表1所示。隨有機溶劑極性的增強,依次萃取得到EAF、NAF和WF,得率EAF>NAF>WF。可見丁香中NCC主要集中在EAF部分,屬弱極性成分。

表1 有機溶劑萃取法分離制備NCC的得率(%)Table 1 Extraction yield of NCC based on the organic solvent extraction and separation method(%)

2.2 NCC對LDL的氧化修飾

2.2.1 NCC抑制LDL中脂類成分的氧化修飾 LDL中脂類含量最高,達76%～79%[2],LDL氧化修飾的延遲和增殖階段主要是脂質中的PUFA發(fā)生氧化[1]。因此,本文首先對NCC作用于LDL脂質氧化的抑制效果進行比較。

LDL中PUFA在脂質氫過氧化反應中被氧化修飾生成次級代謝產物(主要是MDA)[22],MDA等再與TBA共價結合生成紅色產物(即TBARS),其在532 nm波長處有最大吸收峰[23]。通過測定TBARS的OD值可評價NCC抑制LDL脂質氧化效果,結果如圖1所示:空白組的TBARS的OD值高度顯著低于促氧組(p<0.01),添加30 μg/mL NCC各極性相后,TBARS的OD值較促氧組高度顯著降低(p<0.01),NCC抑制能力強弱順序為:EAF>NAF>WF。Fu等[24]也發(fā)現烏桕樹葉EAF對LDL脂質氧化抑制效果強于NAF和WF,與本文結論相似。

圖1 NCC對LDL氧化修飾過程中TBARS產生的抑制效果Fig.1 Inhibition efficiency of NCC on TBARS producing during the oxidation modification process of LDL注：不同大寫字母表示差異高度顯著(p<0.01)。

2.2.2 NCC對LDL中蛋白組分的氧化修飾 LDL在氧化過程中除了脂類被氧化之外,其蛋白部分(21%～24%)也容易發(fā)生氧化修飾[1],這種蛋白氧化主要表現為Trp及Lys殘基氧化修飾[1-2]。

2.2.2.1 NCC對LDL所含Trp的氧化修飾 在上述2.2.1中測定發(fā)現NCC對LDL脂類氧化修飾具有較好抑制效果的基礎上,本文繼續(xù)對NCC抑制LDL所含蛋白apoB100氧化進行測定。

蛋白質分子中,Trp能夠發(fā)射熒光[25],但Trp易受氧化修飾(特別是Cu2+氧化),在氧化延遲階段末期,apoB100被氧化、Trp殘基減少,導致其在Ex295/Em 330 nm處熒光發(fā)生淬滅[26]。熒光強度越高,說明淬滅越少,抑制效果越好[1-2]。

測定NCC抑制Trp熒光淬滅的結果如圖2A所示。在NCC(5 μg/mL)中,對Trp熒光淬滅的抑制效果呈現出顯著性差異(p<0.05),EAF熒光強度最大，抑制效果最強,相比于促氧組呈現出顯著的抑制效果。而NAF及WF的熒光強度均較低,未呈現出明顯的抑制效果。

在上述定量檢測的基礎上,在Ex 280 nm、Em 300～450 nm進行熒光掃描得到結果如圖2B所示。該圖顯示,各樣液熒光強度均在Em 340 nm左右達最高峰。NCC中EAF峰值最高,呈現出較NAF及WF更強的抑制效果,與上述定量結果一致、相互印證。Chen等[17]發(fā)現杏仁皮能夠抑制Trp熒光淬滅的主要原因是富含大量多酚,能夠清除自由基、螯合過渡金屬離子。實驗室前期工作也發(fā)現,EAF的多酚含量顯著高于NAF和WF(p<0.05),可能是EAF中這些多酚對Trp熒光淬滅起主要抑制作用[22]。

圖2 NCC對Trp熒光淬滅的抑制效果Fig.2 Inhibition efficiency of NCC on Trp fluorescence quenching注:A:Trp熒光淬滅定量比較;B:Trp熒光淬滅掃描比較;a:空白;b:BHT 5 μg/mL;c:EAF 5 μg/mL;d:WF 5 μg/mL;e:促氧;f:NAF 5 μg/mL；不同大寫字母表示差異顯著(p<0.05)，圖3同。

2.2.2.2 NCC對LDL所含Lys的氧化修飾 NCC對LDL所含Lys游離氨基活性有衰減作用,LDL蛋白中除了上述Trp容易氧化修飾以外,其中的Lys在LDL氧化修飾的降解階段,脂類氧化產生的醛類終產物(如MDA等)會結合并修飾Lys殘基,導致Lys游離氨基活性降低[27]。Lys游離氨基與TNBS反應形成的復合物在340 nm處有紫外吸收,可用Lys活性高低來表征LDL被氧化修飾程度。吸光度值越高，Lys游離氨基活性越高,被修飾程度越低[2]。

NCC對LDL所含Lys的氧化修飾的測定結果如圖3所示。在NCC中,仍以EAF的OD值最大,WF的OD值最小,EAF對Lys活性衰減的抑制作用顯著高于NAF及WF(p<0.05),且EAF與BHT無顯著性差異,說明NCC中的EAF能有效抑制LDL在氧化過程中Lys游離氨基活性衰減,且其抑制效果甚至達到了同濃度BHT的水平,獲得與2.2.1類似的結果。可能原因是，NCC能抑制LDL脂質氧化修飾,通過減少脂質過氧化物的生成來減少載脂蛋白apoB100中Lys游離氨基衰減。Sicchieri等[26]研究紅酒抑制LDL氧化時也發(fā)現，Lys游離氨基衰減與脂質氧化正相關。

圖3 NCC抑制Lys游離氨基氧化活性衰減結果Fig.3 Results of NCC inhibiting Lys free amino oxidation activity attenuation

對NCC抑制Lys游離氨基氧化過程中熒光光譜變化的比較發(fā)現,PUFA氧化產生的脂質氧化產物(如MDA)會與Lys殘基上的游離氨基共價結合形成希夫堿,該產物在Ex350/Em 400～550 nm有熒光吸收。熒光強度越高，表示氧化修飾程度越強[19]。

為進一步驗證Lys熒光淬滅掃描結果,如圖4所示。各組熒光光譜走勢基本相同,促氧組熒光強度最高,空白組最低。NCC的熒光強度位于促氧組與空白組之間,表明NCC對活性醛和MDA與Lys游離氨基結合具有抑制作用。其中,在NCC中EAF的抑制效果最強,NAF其次,WF最小。Picard等[19]也發(fā)現，氨基胍能抑制MDA等活性醛修飾LDL所含apoB100,NCC也可能通過捕獲脂質過氧化產物分解形成的活性醛,以抑制這些活性醛與Lys結合產生熒光信號[19]。該結果與2.2.2.2中測定Lys游離氨基活性的結果相互印證。

圖4 NCC對活性醛修飾Lys殘基的抑制效果Fig.4 Inhibition efficiency of NCC on reactive aldehyde modified Lys residue注:a:空白;b:BHT 5 μg/mL;c:EAF 5 μg/mL;d:NAF 5 μg/mL;e:WF 5 μg/mL;f:促氧。

2.2.3 NCC抑制總熒光產物及脂褐素產生 LDL氧化修飾不僅體現在上述2.2.1～2.2.2中表現出來的脂質或蛋白組分,還體現在其脂質代謝產物修飾本身所含的蛋白組分。于是,在1.2.3.1、1.2.3.2比較NCC對LDL所含單獨脂類、單獨蛋白氧化抑制的基礎上,進一步對NCC抑制LDL氧化過程中所含脂質代謝產物修飾蛋白組分的抑制效果進行了比較。

總熒光產物和脂褐素是脂質代謝產物與蛋白質過氧化形成的復合產物,它在體內堆積是機體明顯衰老的指標,它反映細胞被自由基損傷的程度[21,28]。按照1.2.3.3和1.2.3.4方法測定NCC抑制LDL氧化過程中總熒光及脂褐素產生效果,結果如圖5所示。可看出,促氧組熒光強度極顯著高于空白組(p<0.001),表明LDL氧化產生大量熒光產物和脂褐素。加入NCC樣液后熒光強度極顯著低于促氧組(p<0.001),表明NCC樣液能有效抑制熒光產物和脂褐素形成。在NCC中,EAF相熒光強度最低，NAF熒光強度次之，WF熒光強度最高(p<0.001),說明EAF對LDL氧化過程中總熒光及脂褐素產生的抑制效果最強。沈勇根等[6]發(fā)現，NCC對清除自由基和脂質過氧化具有很強的抑制能力,且抑制效果排序為:EAF>NAF>WF,與本文對總熒光產物及脂褐素產生的抑制效果排序一致。因總熒光產物及脂褐素為LDL氧化過程中脂類氧化代謝物與蛋白相互作用的產物[21],所以EAF很可能通過有效抑制脂質過氧化產物生成而達到抑制總熒光產物及脂褐素產生的能力。

圖5 NCC對LDL氧化修飾過程中總熒光及脂褐素產生的抑制效果Fig.5 Inhibition efficiency of NCC on the total fluorescenceand lipofuscin production during oxidative modification of LDL注:A. 對熒光產物生成的抑制效果;B.對脂褐素生成的抑制效果；不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.001)，圖8同。

上述試驗中,NCC中EAF有些指標抑制LDL氧化修飾功效不及同濃度的陽性對照BHT,主要原因可能是BHT為分析純,而EAF為混合物,所含成分復雜,不具有氧化抑制效果的雜質較多,導致有效成分含量比同濃度BHT低的緣故。若進一步純化各極性部位，提高有效成分含量,其抑制作用可能會等同、甚至高于同濃度BHT[1]。后續(xù)對EAF分離、純化工作正在進行中。

多酚、黃酮被認為是植物抗氧化活性的主要物質基礎[25]。本文發(fā)現，NCC中EAF對LDL氧化修飾抑制作用最強,為NCC中抗氧化的有效部位[5]。且實驗室前期研究發(fā)現,在NCC中EAF總多酚、總黃酮含量最高,可能正是EAF這些高含量、同時具有強抗氧化活性的多酚、黃酮對LDL氧化修飾的抑制起主要作用[1,6]。王昌祿等[28]通過生物活性追蹤后也發(fā)現，香椿老葉EAF中總多酚及總黃酮含量比NAF和WF高、抗氧化活性最強,為抗氧化有效部位,與本文的結論相似。

2.3 EAF抑制LDL氧化修飾的量效關系

在上述2.2發(fā)現EAF為NCC抑制LDL氧化修飾有效部位的基礎上,本文進一步對EAF抑制LDL氧化修飾的量效關系進行了相關分析。

2.3.1 EAF抑制Trp熒光淬滅的量效關系 對EAF抑制Trp熒光淬滅的掃描結果如圖6。各組Trp熒光光譜走勢相近,各樣品均在Em350.27 nm處有最大熒光強度。由金屬離子Cu2+氧化修飾的促氧組的Trp波峰明顯低于空白組,原因可能是金屬離子Cu2+易攻擊apoB100上的游離氨基酸殘基[17,26]。5 μg/mL EAF波峰與促氧組相近,添加10、15 μg/mL EAF在Em 350.27 nm處波峰依次增大,與濃度正相關,具有良好的量效關系(p<0.001)。Saoudi等[29]也發(fā)現，云芝中的漆酶成分的Trp熒光猝滅與醋酸的濃度有良好的量效關系,與本文研究有相似的結果。

圖6 EAF對Trp熒光掃描淬滅的量效關系Fig.6 Dose-effect relationship of EAF on Trp fluorescence quenching by fluorescence scanning注:a:空白;b:BHT 5 μg/mL;c:EAF 15 μg/mL; d:EAF 10 μg/mL;e:EAF 5 μg/mL;f:促氧。

2.3.2 EAF抑制活性醛修飾Lys殘基的量效關系 上述結果發(fā)現，EAF抑制Trp熒光淬滅呈現較好的量效關系,繼續(xù)對EAF抑制活性醛氧化apoB100中Lys游離氨基的效果進行了分析,結果如圖7所示。各組熒光光譜呈現出相近的走勢,且促氧組熒光強度最高,表明脂質氧化產物與Lys游離氨基結合形成Schiff堿,熒光強度明顯增加[19]。不同濃度EAF熒光強度位于促氧組與空白樣之間,15 μg/mL EAF的峰值甚至比5 μg/mL BHT更低,表明其抑制效果比5 μg/mL BHT更強。高濃度(10、15 μg/mL)EAF顯示出對活性醛修飾Lys良好的抑制效果,可能是因為EAF的成分能夠抑制活性醛產生,以保護Lys殘基不受氧化修飾。Picard等[19]得到了與本文類似的結果。

圖7 EAF對活性醛修飾Lys的量效關系Fig.7 Dose-effect relationship of EAF on active aldehyde modified Lys注:a:空白;b:EAF 15 μg/mL;c:BHT 5 μg/mL; d:EAF 10 μg/mL;e:EAF 5 μg/mL;f:促氧。

2.3.3 EAF抑制總熒光產物產生的量效關系 為進一步測量EAF抑制總熒光產物生成,按照1.2.4.1方法測量結果如圖8所示。其中5 μg/mL EAF的熒光強度低于促氧組,表明在此低濃度的EAF對總熒光產物的產生已顯示出抑制作用。隨著濃度增加到10、15 μg/mL時,抑制作用極顯著增強(p<0.001),呈現出良好的劑量依賴關系。其中,與EAF對Lys氧化抑制效果一樣,15 μg/mL的EAF對總熒光產生的抑制效果也強于5 μg/mL的BHT。王麗麗等[21]也發(fā)現，紫丁香葉提取物對LDL氧化抑制隨濃度增加而增強,與本文結果相似。

圖8 EAF抑制總熒光產物生成的量效關系Fig.8 Dose-effect relationship of EAF inhibiting the total fluorescent products generated

2.3.4 采用三維熒光光譜解析EAF對LDL氧化修飾的抑制效果 為更全面、深入檢測EAF對LDL氧化修飾效果,本文進而采用三維熒光掃描獲得等高線圖來反映其對LDL氧化期間的抑制效果[15],結果如圖9所示。

圖9 三維熒光高線表征EAF抑制LDL氧化修飾的量效關系Fig.9 Dose-effect relationship of EAF on LDL oxidation modification by three-dimensional flourescence contour spectroscopy注:(a)空白組;(b)5 μg/mL EAF;(c)10 μg/mL EAF;(d)15 μg/mL EAF;(e)BHT;(f)促氧組。

圖9(a)為空白組,在Peak A處(Ex280/Em 330 nm)含有一個明顯的熒光發(fā)色團(熒光強度為800),為Trp內源熒光[15]。其熒光信號保持完整,表明LDL受到氧化修飾程度低。圖9(f)為促氧組,在Peak A的熒光強度(190.62)明顯降低,在Peak B(Ex360/Em 430 nm)處出現新的熒光發(fā)色團,熒光強度高達190.62,其熒光信號有明顯發(fā)散且發(fā)射波長出現紅移,顯示出LDL氧化修飾產生的脂質氧化產物與Lys殘基發(fā)生共價結合,形成在該處具有熒光吸收的希夫堿增加了該處的熒光強度[30]。從圖9(b)～圖9(e)可看出,添加不同濃度的EAF和BHT后,LDL氧化修飾產生在Ex280/Em 330 nm(Peak A)處的熒光信號逐漸增大,但均低于空白組;在Peak B處的熒光信號都比促氧組低,表明LDL氧化過程中Trp發(fā)生了不同程度的熒光淬滅,且抑制效果與EAF濃度正相關[17-18]。并且隨濃度增大,EAF對LDL氧化過程中形成希夫堿的抑制作用也增大,從而降低了在Peak B處的熒光強度[30]。

以上結果表明,NCC中EAF能有效抑制Trp熒光淬滅、熒光信號紅移及Lys殘基被修飾,其抑制功效呈現出較好的量效關系。丁香能有效抑制脂質氧化、降低脂質氧化產物含量,間接減少熒光物質產生,本文與Mclean等[31]結果類似。

3 結論

NCC各極性相能不同程度抑制LDL氧化過程中脂質、蛋白及脂質氧化產物修飾蛋白的變化,抑制LDL熒光光譜特性變化,且EAF的抑制效果明顯強于NAF和WF,EAF為NCC抑制LDL氧化修飾的有效部位。不同濃度的EAF對LDL氧化修飾的抑制作用不同,且抑制效果與濃度成正比,呈現出良好的量效關系。本文為后續(xù)重點對NCC中EAF分離、純化及結構分析、闡明丁香抑制LDL氧化修飾物質基礎及功能食品研發(fā)提供參考。