退化和正常窖泥微生物多樣性的比較分析

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(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北襄陽(yáng) 441053)2.湖北古襄陽(yáng)酒業(yè)有限公司,湖北襄陽(yáng) 441100)

根據(jù)生產(chǎn)工藝的差異,白酒可以分為濃香型、醬香型、清香型和米香型四種主體香型,其中濃香型白酒的產(chǎn)量占整個(gè)白酒行業(yè)的70%左右[1]。濃香型白酒主要采用泥窖固態(tài)發(fā)酵,窖泥中蘊(yùn)含著豐富的微生物群系,棲息著大量的乳酸菌、丁酸菌和己酸菌等功能菌,其質(zhì)量在很大程度上決定了酒的品質(zhì)[2]。在濃香型白酒釀造過(guò)程中,由于窖泥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被微生物吸收和利用,同時(shí)有害物質(zhì)不斷積累,進(jìn)而導(dǎo)致窖泥出現(xiàn)退化現(xiàn)象,從而影響了白酒的品質(zhì)。目前,常從色澤、氣味、手感及質(zhì)地等維度對(duì)窖泥的質(zhì)量進(jìn)行判定,但由于感官指標(biāo)的滯后性使多數(shù)生產(chǎn)或研究人員較難及時(shí)預(yù)測(cè)窖泥的質(zhì)量[3]。

窖泥微生物群落組成及多樣性反映了窖泥質(zhì)量,且具有對(duì)外界環(huán)境響應(yīng)比較迅速的特點(diǎn)[4]。通過(guò)采用變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)技術(shù),Liang等[5]對(duì)四川特別是瀘州市成熟及退化窖泥微生物構(gòu)成進(jìn)行了解析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常窖泥與退化窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異,證實(shí)了通過(guò)微生物群落組成預(yù)測(cè)窖泥質(zhì)量的可行性。相對(duì)于DGGE等指紋圖譜技術(shù),高通量測(cè)序技術(shù)克服了指紋圖譜條帶信息量低和無(wú)法實(shí)現(xiàn)樣品間平行分析的缺陷[6],具有通量高和拼裝結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn),目前已經(jīng)在泡菜[7]、臘腸[8]和酸奶[9]等發(fā)酵食品中有了廣泛的應(yīng)用。Hu等[10]應(yīng)用Miseq技術(shù)對(duì)江蘇湯溝濃香型白酒優(yōu)質(zhì)、普通和退化窖泥中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析,研究發(fā)現(xiàn)隨著窖泥質(zhì)量的提升,Lactobacillus(乳酸桿菌)含量顯著減少,而Clostridia(梭菌)和Bacteroidia(擬桿菌)等核心屬的含量明顯增加。作為國(guó)內(nèi)白酒生產(chǎn)與消費(fèi)的重要省份,湖北省白酒生產(chǎn)企業(yè)近450家,銷售收入近800億元[11],然而目前關(guān)于湖北地區(qū)濃香型白酒退化和正常窖泥微生物多樣性比較分析的研究報(bào)道尚少。

本研究從湖北古襄陽(yáng)酒業(yè)正常窖池和廢棄窖池中各采集了5份窖泥樣品,在提取宏基因組DNA的基礎(chǔ)上,使用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析,同時(shí)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,對(duì)與2類窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)菌類群進(jìn)行了甄別,通過(guò)本項(xiàng)目的實(shí)施以期為華中地區(qū)窖泥質(zhì)量預(yù)測(cè)和窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

窖泥 分別采集自湖北古襄陽(yáng)酒業(yè)新舊窖泥車間;E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒 美國(guó)OMEGA公司;10×PCR緩沖液、DNA聚合酶和dNTPs Mix 寶生物工程(大連)有限公司;引物338F/806R(其中正向引物前端加入7個(gè)核苷酸標(biāo)簽) 由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

vetiri梯度基因擴(kuò)增儀 美國(guó)AB公司;Miseq PE300型高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司;FluorChem FC3型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)FluorChem公司;5810R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;DYY-12型電泳儀 北京六一儀器廠;ND-2000C型微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Nano Drop公司;R920型機(jī)架式服務(wù)器 美國(guó)DELL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集及DNA提取 從湖北古襄陽(yáng)酒業(yè)有限公司新舊窖泥車間各選取5個(gè)窖池,從窖底取300 g窖泥裝入無(wú)菌采樣袋中低溫運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室,采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒進(jìn)行微生物宏基因組DNA提取。舊窖泥車間窖池窖齡均為30年,由于新廠搬遷舊窖池已2年未使用,但均填充酒糟并覆蓋窖皮泥進(jìn)行密封。新窖池窖齡為2年,新舊窖池距離約5 km,且深度均為2.2 m。其中退化窖泥組5個(gè)樣品分別命名為D1、D2、D3、D4和D5,正常窖泥組5個(gè)樣品分別命名為N1、N2、N3、N4和N5。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA序列PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序 擴(kuò)增體系為:DNA模板10 ng,10×PCR緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL,5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL,5 μmol/L正向和反向引物各0.8 μL,體系用ddH2O補(bǔ)充至20 μL。擴(kuò)增條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min。檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 序列質(zhì)控 將下機(jī)序列拼接后依照核苷酸標(biāo)簽(barcode)信息劃分到各樣品,同時(shí)將barcode和引物予以切除進(jìn)而得到高質(zhì)量的序列。拼接過(guò)程中序列應(yīng)滿足如下要求,否則予以刪除:重疊區(qū)大于等于10 bp;最大錯(cuò)配比率小于等于0.2;barcode堿基無(wú)錯(cuò)配;引物堿基錯(cuò)配數(shù)小于等于2 bp。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 采用QIIME(v1.70)平臺(tái)[12]進(jìn)行2類窖泥細(xì)菌物種分析和多樣性評(píng)價(jià)。主要的處理流程為:a.采用PyNAST校準(zhǔn)并把序列排齊[13];b.采用兩步UCLUST法依次按照100%和97%相似性進(jìn)行無(wú)重復(fù)的單一序列集和分類操作單元(Operational taxonomic units,OTU)構(gòu)建[14];c.應(yīng)用ChimeraSlayer去除含有嵌合體序列的OTU[15];d.從去除嵌合體的OTU中選取代表性序列,使用RDP(Ribosomal database project,Release 11.5)[16]和Greengenes(Release 13.8)[17]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列同源性比對(duì),在門(mén)、綱、目、科和屬水平上對(duì)其分類學(xué)地位進(jìn)行明確。若隸屬于某一門(mén)或?qū)俚臉悠吩?0個(gè)窖泥樣品中的平均相對(duì)含量大于1.0%,則將其定義為優(yōu)勢(shì)門(mén)或?qū)賉18]。e.從去除嵌合體的OTU中選取代表性序列,使用FastTree軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[19],并對(duì)超1指數(shù)(Chao1 index)和香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)等α多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算[20]。f.基于UniFrac距離[21]進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal coordinate analysis,PCoA)和非加權(quán)組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚類分析,進(jìn)而完成不同樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的β多樣性分析。

1.2.5 核酸登錄號(hào) 序列數(shù)據(jù)提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metagenomics.anl.gov/),登錄號(hào)為mgp83663。

1.2.6 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Mann-Whiney檢驗(yàn)對(duì)2類窖泥微生物群落的超1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)和屬平均相對(duì)含量進(jìn)行顯著性分析;采用多元方差分析(Multivariate analysis of variance,MANOVA)對(duì)2類窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性進(jìn)行分析;采用冗余分析(Redundancy analysis,RDA)對(duì)與2類窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著相關(guān)的關(guān)鍵類群進(jìn)行甄別;采用歐式距離對(duì)2類窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組間差異進(jìn)行計(jì)算。使用Canoco 4.5軟件繪制RDA圖,使用Matlab 2010b軟件繪制熱圖,使用Mega5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),其他圖使用Origin 8.6軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

在提取窖泥微生物宏基因組DNA的基礎(chǔ)上,本研究采用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2類窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析,10個(gè)樣品共產(chǎn)生280822條高質(zhì)量序列,平均每個(gè)樣品28082條。在使用PyNAST將序列對(duì)齊時(shí),有840條序列比對(duì)失敗,因而共有279982條序列進(jìn)行了OTU的劃分。10個(gè)窖泥樣品16S rDNA V4～V5區(qū)序列測(cè)序情況及各分類地位數(shù)量如表1所示。

表1 樣品16S rDNA測(cè)序情況及各分類地位數(shù)量Table 1 16S rDNA read counts and number of identifiable units at different taxonomical levels

由表1可知,本研究采用兩步UCLUST法進(jìn)行了OTU的劃分,根據(jù)序列100%相似性聚類分析后,挑選出了100439條代表性序列,根據(jù)序列97.0%相似性聚類分析后,得到了14368個(gè)OTU,經(jīng)嵌合體檢查后去除了6762個(gè)OTU,還剩余7606個(gè)OTU,平均每個(gè)樣品1339個(gè)。在OTU劃分的基礎(chǔ)上,本研究將序列鑒定為26個(gè)門(mén)、66個(gè)綱、108個(gè)目、233個(gè)科和524 屬,其中有0.034%和14.31%的序列不能鑒定到門(mén)和屬水平。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)和嵌合體去除后,含有序列數(shù)最少的樣品有18588條序列,故而在進(jìn)行α多樣性計(jì)算時(shí),所有樣品測(cè)序深度均取18510條序列。經(jīng)Mann-Whiney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),退化窖泥微生物群落的超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均顯著高于正常窖泥(p<0.05),這說(shuō)明窖泥退化后其細(xì)菌的多樣性和豐度均會(huì)顯著提升。

2.2 基于各分類學(xué)地位相對(duì)含量的2類窖泥細(xì)菌構(gòu)成研究

在序列豐富度和多樣性分析的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步基于分類學(xué)地位“門(mén)”和“屬”水平對(duì)窖泥細(xì)菌構(gòu)成進(jìn)行了揭示,2類窖泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)相對(duì)含量的比較分析如圖1所示。

圖1 2類窖泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)相對(duì)含量的比較分析Fig.1 Relative abundances of the majorbacterial phyla among 2 types pid mud samples

由圖1可知,退化窖泥中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌門(mén)及其含量分別為:Firmicutes(硬壁菌門(mén),68.70%)、Bacteroidetes(擬桿菌門(mén),13.80%)、Spirochaetes(螺旋體門(mén),4.86%)、Synergistetes(互養(yǎng)菌門(mén),3.70%)、Chloroflexi(綠彎菌門(mén),3.53%)、Proteobacteria(變形菌門(mén),1.84%)和Actinobacteria(放線菌門(mén),1.89%)。正常窖泥中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌門(mén)及其含量分別為:Firmicutes(硬壁菌門(mén),86.79%)、Proteobacteria(變形菌門(mén),6.28%)、Actinobacteria(放線菌門(mén),4.65%)和Bacteroidetes(擬桿菌門(mén),1.29%)。經(jīng)Mann-Whiney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),退化窖泥中Spirochaetes(螺旋體門(mén))、Synergistetes(互養(yǎng)菌門(mén))和Chloroflexi(綠彎菌門(mén))相對(duì)含量顯著高于正常窖泥(p<0.05)。2類窖泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量的比較分析如圖2所示。

圖2 2類窖泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量的比較分析Fig.2 Relative abundances of the major bacterial genera among 2 types pid mud samples

由圖2可知,退化窖泥中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌屬及其含量分別為:隸屬于Firmicutes(硬壁菌門(mén))的Clostridium(梭菌,14.77%)、Syntrophaceticus(12.01%)、Syntrophomonas(互營(yíng)單胞菌屬,8.21%)、Sedimentibacter(沉淀?xiàng)U菌屬,3.93%)、Lysinibacillus(梭形桿菌屬,3.11%)、Pelotomaculum(2.05%)和Lactobacillus(乳酸桿菌,1.01%);隸屬于Bacteroidetes(擬桿菌門(mén))的Petrimonas(6.01%);隸屬于Synergistetes(互養(yǎng)菌門(mén))的Aminobacterium(胺小桿菌屬,4.08%)。正常窖泥中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌屬及其含量分別為:隸屬于Firmicutes(硬壁菌門(mén))的Lactobacillus(乳酸桿菌,67.91%)、Clostridium(梭菌,4.49%)和Bacillus(芽孢桿菌,3.80%);隸屬于Proteobacteria(變形菌門(mén))的Ralstonia(雷爾氏菌屬,3.65%)和隸屬于Actinobacteria(放線菌門(mén))的Nocardia(諾卡氏菌屬,2.41%)。

經(jīng)Mann-Whiney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),退化窖泥中Clostridium(梭菌)、Syntrophaceticus、Syntrophomonas(互營(yíng)單胞菌屬)、Petrimonas、Sedimentibacter(沉淀?xiàng)U菌屬)、Aminobacterium(胺小桿菌屬)、Lysinibacillus(梭形桿菌屬)和Pelotomaculum的相對(duì)含量顯著高于正常窖泥(p<0.05),而Lactobacillus(乳酸桿菌)、Bacillus(芽孢桿菌)、Ralstonia(雷爾氏菌屬)和Nocardia(諾卡氏菌屬)呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)(p<0.05)。

2.3 基于多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的2類窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究

在完成2類窖泥微生物構(gòu)成解析的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步采用基于OTU水平加權(quán)UniFrac距離的PCoA和UPGMA對(duì)10個(gè)窖泥樣品的β多樣性進(jìn)行了揭示,基于分類操作單元加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析如圖3所示。

圖3 基于分類操作單元加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal coordinate analysis of OTUs based on weighted unifrac distance

由圖3可知,在以2個(gè)權(quán)重最高的主成分PC1和PC2作圖時(shí),退化窖泥樣品分布在一四象限,而正常窖泥分布在二三象限,其中第1和第2主成分分別占全部變量72.22%和8.87%的權(quán)重。由此可見(jiàn),退化窖泥和正常窖泥樣品在空間排布上呈現(xiàn)出明顯的區(qū)分,這說(shuō)明兩者微生物群落結(jié)構(gòu)可能存在較大差異。為了對(duì)這一結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,本研究采用UPGMA對(duì)2類窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于分類操作單元加權(quán)UniFrac距離的UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA clustering analysis of OTUs based on weighted unifrac distance

由圖4可知,聚類I由退化窖泥樣品構(gòu)成,聚類II由正常窖泥樣品構(gòu)成。由此可見(jiàn),UPGMA結(jié)果與PCoA結(jié)果一致,即2類窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)可能存在較大的差異。在采用非監(jiān)督多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上,本研究選取了PCoA前80%的PC進(jìn)行了MANOVA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常窖泥和退化窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)差異極顯著(p<0.001)。

由圖3亦可知,退化窖泥樣品的空間排布較之正常窖泥分散,這說(shuō)明退化窖泥樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的組間差異可能要高于正常窖泥,本研究進(jìn)一步基于歐氏距離對(duì)該推論進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果如圖5所示。

圖5 基于歐氏距離的2類窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組間差異分析Fig.5 Differences in the bacterial community structure between 2 types pid mud samples calculated by euclidean distances

2.4 關(guān)鍵細(xì)菌類群的甄別

采用基于OTU水平加權(quán)UniFrac距離的PCoA和UPGMA分析發(fā)現(xiàn),正常窖泥和退化窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)差異極顯著(p<0.01),本研究以窖泥分組(正常/退化)為起約束作用的解釋變量,以平均相對(duì)含量大于0.5% OTU為響應(yīng)變量,采用RDA對(duì)導(dǎo)致2類窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著的關(guān)鍵細(xì)菌類群進(jìn)行了甄別。數(shù)據(jù)中有35.2%的變異度能夠被退化窖泥/正常窖泥分組所解釋,而通過(guò)蒙特卡羅置換檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這一約束因素具有顯著性(p<0.05)。RDA雙序圖如圖6所示。

圖6 RDA雙序圖Fig.6 Biplot of the RDA

由圖6可知,OTU11613、OTU2965、OTU1586、OTU5725、OTU9805、OTU7629、OTU2455、OTU4543和OTU1402共9個(gè)OTU與RDA排序圖約束軸上的樣本賦值良好相關(guān),由此可見(jiàn),9個(gè)OTU代表了2類窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)菌類群。在RDA排序圖中可以看到,隸屬于Clostridium(梭菌)的OTU9805和OTU7629、隸屬于Syntrophomonas(互營(yíng)單胞菌屬)的OTU2455、隸屬于Pelotomaculum的OTU4543和隸屬于Synergistaceae(互養(yǎng)菌科)的OTU1402位于圖的右側(cè)(即退化窖泥),這說(shuō)明該5個(gè)OTU在退化窖泥中的相對(duì)含量可能較高;OTU11613、OTU2965、OTU1586和OTU5725 4個(gè)隸屬于Lactobacillus(乳酸桿菌)的OTU位于圖的左側(cè)(即正常窖泥),這說(shuō)明該4個(gè)OTU在正常窖泥中的相對(duì)含量可能較高。9個(gè)關(guān)鍵OTU在各樣品中相對(duì)含量的熱圖如圖7所示。

圖7 9個(gè)關(guān)鍵OTU在各樣品中相對(duì)含量的熱圖Fig.7 Relative abundances of the 9 OTUs identified as key variables for the differentiation of microbiota in 2 types pid mud samples注:左側(cè)為系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

由圖7可知,OTU9805、OTU1402、OTU7629、OTU2455和OTU4543在退化窖泥中的平均相對(duì)含量分別為2.57%、2.27%、1.36%、1.40%和1.20%,而在正常窖泥中平均相對(duì)含量亦均小于0.1%。與此相反,OTU11613在正常窖泥中的平均相對(duì)含量顯著高于退化窖泥,其在正常窖泥中含量為56.27%,而在退化窖泥中僅為0.70%。此外,OTU2965、OTU1586和OTU5725在正常窖泥中的平均相對(duì)含量分別為4.21%、4.09%和3.29%,而在退化窖泥中的含量均小于0.1%。Mann-Whitney檢驗(yàn)的結(jié)果顯示,除均隸屬于Lactobacillus(乳酸桿菌)的OTU1586和OTU5725外,其他7個(gè)OTU在2類窖泥中的差異具有統(tǒng)計(jì)上的顯著性(p<0.05)。

3 討論與結(jié)論

窖泥的質(zhì)量直接決定了濃香型白酒的質(zhì)量,正常的窖泥為灰褐(黑)色,有較強(qiáng)的酯香味和微弱的硫化氫氣味,而退化窖泥為銀灰色或白色針狀晶體結(jié)塊,酯香氣較弱。雖然通過(guò)感官特征可以對(duì)窖泥的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),但其變化較其中微生物群落組成及物種多樣性變化緩慢[11]。香農(nóng)指數(shù)廣泛應(yīng)用于生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)[22],窖泥微生物群落的多樣性受空間[23]和窖齡[24-25]的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，退化窖泥細(xì)菌群落的香農(nóng)指數(shù)均較之正常窖泥高。隨著窖泥的退化,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌微生物群落組成在原有Firmicutes(硬壁菌門(mén))、Proteobacteria(變形菌門(mén))、Actinobacteria(放線菌門(mén))和Bacteroidetes(擬桿菌門(mén))4 個(gè)門(mén)的基礎(chǔ)上,又增加了Spirochaetes(螺旋體門(mén))、Synergistetes(互養(yǎng)菌門(mén))和Chloroflexi(綠彎菌門(mén))3個(gè)門(mén),同時(shí)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬也從5個(gè)增加到9個(gè)。通過(guò)對(duì)江蘇湯溝濃香型白酒優(yōu)質(zhì)、普通和退化窖泥中細(xì)菌多樣性進(jìn)行對(duì)照分析,Hu等[10]發(fā)現(xiàn)，正常窖泥細(xì)菌群落的香農(nóng)指數(shù)高于退化窖泥而與優(yōu)質(zhì)窖泥差異不顯著,其研究結(jié)論與本研究不同的原因可能在于兩個(gè)研究中退化窖泥的選擇不同,Hu選擇的退化窖泥采集自尚在使用中的窖池,而本研究采集的退化窖泥來(lái)自已2年未使用的窖池。

作為正常窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌,本研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus(乳酸桿菌)的平均含量高達(dá)67.91%。雖然有研究指出乳酸菌含量過(guò)高會(huì)影響窖泥的品質(zhì)[11],但其產(chǎn)生的乳酸菌可與乙醇生成乳酸乙酯,同時(shí)對(duì)雜菌的生長(zhǎng)亦有一定的抑制作用[26]。通過(guò)采用DGGE技術(shù)對(duì)瀘州老窖窖泥中的乳酸菌多樣性進(jìn)行分析,熊亞等[27]發(fā)現(xiàn)耐酸乳桿菌(L.acetotolerans)為窖泥中乳酸菌的優(yōu)勢(shì)種群。王葳等[28]亦使用純培養(yǎng)方法從窖泥中分離出了L.zeae(玉米乳桿菌)、L.pentosus(戊糖乳桿菌)和Pediococcusacidilactici(乳酸片球菌)。通過(guò)產(chǎn)生己酸、丁酸和氫[29],梭菌對(duì)濃香型白酒香氣的形成亦起著重要作用[30],古襄陽(yáng)酒業(yè)為了加快窖泥的熟化通常會(huì)向新窖池中加入梭狀芽胞桿菌。本研究發(fā)現(xiàn)退化窖泥中Clostridium(梭菌)的相對(duì)含量反而高于正常窖泥,這可能是由于Miseq高通量測(cè)序只能實(shí)現(xiàn)微生物屬的相對(duì)定量,因而在后續(xù)研究中進(jìn)一步使用qPCR對(duì)窖泥中梭菌進(jìn)行絕對(duì)定量是極為必要的。

本研究通過(guò)對(duì)與退化窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)菌類群進(jìn)行甄別,證實(shí)了細(xì)菌多樣性可以較為科學(xué)的判定窖泥質(zhì)量,進(jìn)而為后續(xù)窖泥質(zhì)量?jī)?yōu)化和退化防止提供了一定的理論支撐。由于本研究的退化窖泥樣品采集自已兩年未使用的窖池,因此在后續(xù)研究中，從正在使用的窖池中采集退化窖泥樣品,并對(duì)其細(xì)菌多樣性進(jìn)行揭示,從而進(jìn)一步檢驗(yàn)和完善本研究的結(jié)果是極為必要的。