白菜葉際細菌多樣性與毒死蜱降解菌篩選及分離鑒定

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(1.北京聯合大學生物化學工程學院,北京 100023;2.中國科學院大學資源與環境學院,北京 100190;3.中國科學院生態環境研究中心,北京 100085)

葉際,即植物的地上部分,是地球上最大的微生物棲息地之一,其總面積可達4×108多平方千米[1-2]。植物葉際生存著復雜多樣的微生物群落[3-4],被稱為葉際微生物,包括細菌、真菌、藻類和原生動物等[5-6],其中細菌數量最多,可達106～107cfu/cm2葉面積[2]。葉際微生物與宿主植物的關系十分復雜,既有抵御病害微生物、固氮、促進生長和分解殘留農藥等正面作用[7-8],也有引發植物病害等負面作用[9-10]。

農藥因在防治農作物病蟲草鼠害方面具有高效、快速、經濟、簡便等特點而被廣泛使用。然而,毒農藥的殘留問題也隨之成為環境、食品等領域需要解決的突出問題[11]。農藥在蔬菜初級品以及加工品中均存在,給食品安全帶來了極大挑戰[12]。有機磷農藥作為一類廣譜、高效的殺蟲和除草劑常被用于果蔬等農作物的害蟲防治,但其大量使用對人、動物和環境產生的危害也日趨嚴重[13]。毒死蜱(chlorpyrifos)作為一種有機磷殺蟲、殺螨劑,由于具有殺蟲譜廣、毒性中等優點，逐漸取代了一些高毒農藥,因此在農業生產中使用范圍越來越廣,用量越來越大,對土壤、大氣、水等環境均造成污染[14-16]。食品中毒死蜱殘留超標問題嚴重,影響人們膳食消費安全[17]。農藥的微生物降解農藥因其操作簡單、降解徹底、無二次污染等優點,一直是國內外的研究熱點[18],其在受污染的土壤與水體生物修復中得到了認可,具有良好的應用前景[19]。

農藥殘留的微生物降解一直是食品安全領域的研究熱點,已報道的能降解有機磷農藥的微生物包含細菌、真菌、放線菌、藻類等,其中細菌在生化上的適應能力多變,易受外界條件影響而誘發突變,屬于重要的農藥降解微生物之一。但是,已報道的農藥殘留降解菌大多數都是從土壤或水體底泥中分離富集獲得[20-21],而從植物葉際分離農藥殘留降解菌的文獻卻很少。

白菜為十字花科綠葉蔬菜,屬于蕓苔屬植物,富含纖維素、維生素和礦物質等物質[22-24]。目前白菜已成為世界上均衡膳食的重要組成成分[25]。本文選用幼苗期體型較小的白菜為研究對象,考察完整白菜葉際的細菌多樣性,并從中篩選和鑒定毒死蜱降解菌,為深入研究毒死蜱降解菌的降解特性、應用和機理提供基礎,有利于白菜的食用安全和人體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白菜 十字花科蕓薹屬,種植在北京市懷柔區實驗基地,日平均氣溫約為24.2 ℃,日平均相對濕度約為63.3%。白菜生長至幼苗期后,隨機選取白菜葉片,進行相關實驗分析。毒死蜱乳油(480 g/L) 江蘇寶靈化工股份有限公司;引物27f和1492r、LB 上海生工生物工程技術服務有限公司;2×MIX、TaKaRa、Tris-Base、QXTD和PDA 青島高科園海博生物技術有限公司;高氏Ⅰ號培養基和瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司;毒死蜱標準品(1 mg/mL) 國家質量監督檢驗檢疫總局;乙腈(HPLC級) 瑞典Oceanpak公司;N-丙基乙二胺(PSA)(粒度40～60 μm) 美國Agela Technologies公司;石墨化炭黑(GCB)(120～400 Mesh) 美國Sepax Technologies 公司;其他試劑 均為分析純。

LB Agar培養基:LB Agar粉 40 g,蒸餾水1 L,分裝,121 ℃滅菌20 min;LB培養基:LB粉25 g,蒸餾水1 L;分裝,121 ℃滅菌20 min;PDA培養基:PDA粉46 g,蒸餾水1 L;分裝,在115 ℃滅菌20 min;高氏Ⅰ號培養基:高氏Ⅰ號粉34 g,蒸餾水1 L;分裝,121 ℃滅菌20 min;無機鹽養基:K2HPO4·3H2O 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,KH2PO40.5 g,NaCl 0.2 g,CaCl20.1 g,MnSO40.001 g,FeSO40.001 g,(NH4)2SO41.0 g,H2O 1 L;含有100 mg/L毒死蜱無機鹽培養基:向無機鹽養基中加入適量毒死蜱,使其濃度達到100 mg/L。

DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 安捷倫公司;C18(孔徑6 nm,粒度40～60 μm) 美國Sepax Technologies公司;GC-MS-QP2010 ultra 島津制造所;QUINTIX1102-1CN電子天平 北京塞爾里斯科學儀器有限公司;VM-10渦旋振蕩器 韓國Daihan Scientific公司;THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠;SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司制造;TGL-20M高速臺式冷凍離心儀 湘儀離心機廠;EDC-810型基因擴增儀 東盛國際貿易有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302) 天津生化科技(北京)有限公司;MB100.49型微孔板恒溫振蕩器 杭州奧盛儀器有限公司;BG-Pwer 600 i型電泳儀電源 北京百晶生物技術有限公司;DY-12型電泳成像儀 Alpha Imager。

1.2 實驗方法

1.2.1 白菜葉際細菌的分離 在凈化工作臺中取10 g白菜葉片樣品放入200 mL無菌磷酸緩沖鹽溶液(pH7.0)中密封好[26],接著超聲波振蕩(40 kHz)8 min,然后搖床培養(180 r/min,室溫)30 min,再超聲波振蕩(40 kHz)2 min,最后在凈化工作臺中取出葉片樣品,取菌液備用。

取10 g白菜葉片樣品放入200 mL無菌磷酸緩沖鹽溶液(pH7.0)中[26],先超聲波振蕩(40 kHz)8 min,然后搖床培養(180 r/min,室溫)30 min,再超聲波振蕩(40 kHz)2 min,最后無菌操作下取出葉片樣品,取菌液備用。

1.2.2 白菜葉際細菌數量的檢測 分別用LB、PDA、高氏一號以及100 mg/L毒死蜱的無機鹽培養基對白菜葉際細菌進行分離,按10倍依次稀釋涂平板,30 ℃培養24 h,菌落長成后計數,挑取形態不一的菌株純化、鑒定和保藏。

1.2.3 菌株的保藏和活化 將分離好的菌株斜面,于4 ℃冰箱內保存備用。將保存好的菌株斜面劃線涂平板,30 ℃條件下培養24 h后,挑出性狀保持良好的菌落,接種于液體培養基中,于180 r/min、30 ℃培養24 h后,再轉接3～4代后,菌株活性基本恢復正常。

1.2.4 白菜葉際細菌DNA的提取 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取白菜葉際細菌基因組DNA,回收DNA溶液,經由Nanodrop儀器檢測其濃度。

1.2.5 16S rDNA擴增 采用細菌通用引物,27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492r 5′-TACGGYTACCTTG TTACGACTT-3′。PCR 反應體系:2×MIX 25 μL,27f(10 μmol·μL-1)1 μL,1429r(10 μmol ·μL-1)1 μL,模板是1 μL的細菌DNA,加入ddH2O至反應體系總體積為50 μL。反應條件:預變性95 ℃ 10 min,變性94 ℃ 45 s,退火55 ℃ 45 s,延伸72 ℃ 1 min,35個循環;最后72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠對PCR反應產物進行電泳檢測。

1.2.6 測序與比對 將葉際細菌DNA樣品送至北京瑞博公司進行測序,所測序列經Blast序列比對,對菌株進行分子鑒定。

1.2.7 毒死蜱降解 挑取具有毒死蜱降解活性的菌株于含100 mg/L毒死蜱的無機鹽培養基中，30 ℃活化培養24 h,即得種子液。將種子液按5%接種量接種到含有100 mg/L毒死蜱無機鹽培養基中,即實驗組,以未接種發酵培養液為空白組。不同處理組同時置于搖床上振蕩培養24 h,培養條件為30 ℃,180 r/min。每個實驗組有3個平行,分別采樣測定毒死蜱殘留量。

1.2.8 毒死蜱降解率檢測 采用QuEChERS-GC/MS(快速、容易、便宜、有效、穩定和可靠-氣相色譜/質譜聯用法)檢測毒死蜱降解菌對毒死蜱的降解率。

1.2.8.1 樣品預處理 精確量取15 mL含毒死蜱發酵液試樣于50 mL聚乙烯離心管中,加入3 g氯化鈉、1.5 g無水乙酸鈉及15 mL 1%乙酸乙腈溶液,漩渦1 min后,以5000 r/min離心10 min。

1.2.8.2 凈化 取2 mL上清液轉入裝有100 mg PSA(N-丙基乙二胺)、100 mg C18(C18烷基-硅膠)、300 mg無水MgSO4和30 mg GCB(石墨化炭黑)的5 mL離心管中,漩渦1 min使其混勻,以5000 r/min離心10 min,上清液過0.22 μm濾膜,收集于自動進樣瓶中,供GC-MS檢測。

1.2.8.3 氣相色譜條件 安捷倫DB-5MS 色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),柱溫50 ℃ 保持2 min,以10 ℃/min升溫至180 ℃,保持1 min,再以6 ℃/min升溫至270 ℃,保持7 min;柱流速1.0 mL/min;進樣口溫度280 ℃;進樣方式:不分流進樣,高壓進樣(100 kPa),1.5 min后開閥;進樣體積1 μL。

1.2.8.4 質譜條件 電子轟擊源(EI)電離方式,70 eV;離子源溫度200 ℃;離子源電壓1.20 kV。

1.2.8.5 標準曲線的繪制 取一定量的毒死蜱標準儲備液(10 mg/L),用乙腈稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的標準液,進行標準曲線的繪制。

1.2.8.6 毒死蜱降解率的計算 計算公式:R(%)=(C0-C1)/C0×100

其中,R代表菌株對毒死蜱的降解率;C1為實驗組毒死蜱濃度(mg/L);C0為空白組毒死蜱濃度(mg/L)。

1.3 數據統計分析

將Blast比對后的序列經由MEGA 5軟件進行系統發育樹的構建。

2 結果與分析

2.1 白菜葉際細菌分離和計數

用LB、PDA、改良高氏一號和含100 mg/L毒死蜱無機鹽培養基對白菜葉際細菌進行分離,分別獲得表型差異較明顯的細菌菌株29株、4株、7株和11株,共獲得51株表型差異較明顯的細菌菌株。另外LB、PDA、改良高氏一號和含100 mg/L毒死蜱無機鹽培養基上細菌的濃度分別為1.24×106、1.03×104、2.07×104和2.64×105CFU/g。可見,不同培養基篩選到的白菜葉際細菌在數量上存在多樣性。

2.2 LB培養基分離白菜葉際細菌的多樣性

將LB培養基上分離培養所得細菌的DNA樣品測序,將所測序列經Blast序列比對,得出16S rDNA 序列相似性為99%～100%,如表1所示。將Blast比對后序列經由MEGA5軟件進行系統發育樹的構建,系統發育樹表征了這些菌株間親緣關系和白菜葉際細菌多樣性,結果見圖1。LB培養基上分離獲得29株表型差異較明顯的細菌,經分子鑒定,它們分別屬腸桿菌屬(Enterobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、農桿菌屬(Argobacterium)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、微桿菌屬(Microbacterium)和嗜麥芽窄食單孢菌(Stenotrophomonas),其中腸桿菌屬為優勢菌屬,其在所有分離鑒定菌株中所占比例約為28.0%;而假單孢菌屬次之,約為21.0%。

表1 LB培養基分離白菜葉際細菌多樣性Table 1 Diversity of bacteria separated by LB medium from phyllosphere of Brassica chinensis

圖1 LB培養基分離白菜葉際細菌的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of bacteria separated by LB medium from phyllosphere of Brassica Chinensis

2.3 PDA培養基分離白菜葉際細菌的多樣性

將PDA培養基上分離培養所得細菌的DNA樣品測序,并進行Blast序列比對(表2)和構建系統發育樹(圖2)。系統發育樹表征了這些菌株間親緣關系和白菜葉際細菌多樣性。PDA培養基上分離獲得4株表型差異較明顯的細菌,它們分別屬腸桿菌屬(Enterobacter)和泛菌屬(Pantoea),其中腸桿菌屬為優勢菌,其在所有分離鑒定菌株中所占比例為75.0%,其16S rDNA序列相似性為99%～100%。

表2 PDA培養基分離白菜葉際細菌多樣性Table 2 Diversity of bacteria separated by PDA medium from phyllosphere of Brassica chinensis

圖2 PDA培養基分離白菜葉際細菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of bacteria separated by PDA medium from phyllosphere of Brassica chinensis

2.4 高氏一號培養基分離白菜葉際細菌的多樣性分析

將高氏一號培養基上分離培養所得細菌的DNA樣品測序,并進行Blast序列比對(表3)和構建系統發育樹(圖3)。系統發育樹表征了這些菌株間親緣關系和白菜葉際細菌多樣性。高氏一號培養基上分離獲得7株表型差異較明顯的細菌,它們均屬于節桿菌屬(Anthrobacter),其16S rDNA序列相似性為99%～100%。

圖3 高氏一號培養基分離白菜葉際細菌的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria separated by high one medium from phyllosphere of Brassica chinensis

表3 高氏一號培養基分離白菜葉際細菌多樣性Table 3 Diversity of bacteria separated by High one medium from phyllosphere of Brassica chinensis

2.5 毒死蜱無機鹽培養基分離白菜葉際細菌多樣性及毒死蜱降解菌分離鑒定

將含100 mg/L毒死蜱的無機鹽培養基上分離培養所得細菌的DNA樣品進行測序,并進行Blast序列比對(表4)和構建系統發育樹(圖4);最后將篩選出的細菌進行毒死蜱降解實驗,結果見表4。結果分離得到毒死蜱降解率較高的11株細菌,主要是沙雷氏菌屬(Serratia)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、嗜麥芽窄食單孢菌屬(Stenotrophomonas)和腸桿菌屬(Enterobacter),其中,假單孢菌屬為優勢菌,其在所有分離鑒定菌株中所占比例為55%,其16S rDNA序列相似性為 99%～100%。其中對毒死蜱降解率最高的菌株是沙雷氏菌(Serratiaureilytica)M1,其降解率達到52.44%;而惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)M9菌株對毒死蜱的降解率最低,為29.16%。可見,篩選鑒定的11株細菌均表現出對毒死蜱具有良好的降解效果。

圖4 毒死蜱無機鹽培養基分離白菜葉際細菌的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of bacteria separated by inorganic salt medium containing 100 mg/L chlorpyrifos from phyllosphere of Brassica Chinensis

表4 毒死蜱無機鹽培養基分離白菜葉際細菌多樣性與毒死蜱降解菌分離鑒定Table 4 Diversity of bacteria,isolation and identification of chlorpyrifos-degradating strains by inorganic salt medium containing 100 mg/L chlorpyrifos on phyllosphere of Brassica chinensis

3 結論

本文分別采用LB、PDA、改良高氏一號和含100 mg/L毒死蜱無機鹽培養基對白菜葉際細菌進行分離,共獲得51株表型差異較明顯的細菌,這與系統發育樹表征的結果一致;其中LB、PDA、改良高氏一號和含100 mg/L毒死蜱無機鹽培養基的細菌濃度分別為1.24×106、1.03×104、2.07×104和2.64×105CFU/g,表明不同培養基篩選到的白菜葉際細菌在數量上存在多樣性。進一步分離培養、分子鑒定和系統發育樹構建,系統發育樹表征了這些菌株間親緣關系和白菜葉際細菌多樣性。結果顯示各培養基的優勢菌分別是腸桿菌屬28%、腸桿菌屬75%、節桿菌屬100%,假單孢菌屬55%。

篩選鑒定到11株具有一定毒死蜱降解活性的菌株,分別屬粘質沙雷氏菌屬(Serratia)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、嗜麥芽窄食單孢菌屬(Stenotrophomonas)和腸桿菌屬(Enterobacter);它們均表現出對毒死蜱具有良好的降解效果,其中沙雷氏菌(Serratiaureilytica)M1菌株對毒死蜱的降解率最高,達到52.44%。不同培養基從白菜葉際分離鑒定的細菌多樣性差異明顯,從白菜葉際篩選鑒定出毒死蜱降解菌率較高的細菌菌株,為毒死蜱降解菌的降解特性、應用和機理研究提供了基礎。