植物乳桿菌細菌素高產菌株的誘變選育及其對肉丸的防腐保鮮作用

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(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

細菌素是由核糖體合成的一類有抑菌作用的多肽或蛋白質[1],作為一種天然安全的生物防腐劑,細菌素細胞毒性低,進入人體胃腸道會被分解,不會對人體健康產生影響,在食品防腐劑、飼料添加劑以及制藥領域有很好的應用前景[2-4]。但是從自然界篩選的野生菌細菌素產量通常較低,無法大量生產,不利于細菌素的工業化應用。應用理化誘變與基因組改組技術，可以提高細菌素的產量。常溫等離子體誘變(ARTP)能夠在常溫條件下產生高活性粒子濃度的等離子體射流[5],這些活性粒子到達菌體表面,能夠引起細胞膜和細胞壁通透性改變,從而導致基因損傷引發突變[6]。甲基硝基亞硝基胍(MNNG)是一種應用廣泛的化學誘變劑[7],可以作用于DNA,引起DNA損傷,導致遺傳物質改變,細胞的生長發生改變[8]。基因組改組即細胞融合技術是菌株改良和生物代謝工程中的重要方法[9]。它利用原生質體融合的方式對親本菌株進行基因的隨機重組,以使得目的性狀得以提高[10-12]。相比于傳統誘變方法,基因組改組周期短,在不清楚基因序列的情況下，可以對親本菌株的基因組隨機重組,獲得優良性狀集中的菌株。利用基因組改組可以提高菌株耐受性[13-15]，提高底物利用率[16-18]，提高底物產量[19-21]。

本實驗以前期實驗室分離篩選得到的一株產細菌素的L.plantarumJL-A65為出發菌株,旨在采用等離子誘變和甲基硝基亞硝基胍誘變兩種方式提高細菌素的產量,并以此為親本庫進行基因組改組,進一步提高細菌素的產量。最后將雙乙酸鈉與細菌素復配后應用于肉制品中,研究對肉制品的防腐保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌JL-A65 南京農業大學食品科技學院酶工程實驗室;大腸桿菌(ATCC25922) 南京農業大學食品科技學院酶工程實驗室;平板菌落計數(PCA)培養基 北京陸橋生物技術有限公司;MRS培養基、LB培養基、再生培養基、原生質體緩沖液(LPB)所用試劑 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;生理鹽水、NaCl(濃度0.85%)、溶菌酶溶液(100 mg/mL)、乙腈 色譜純,美國B&J公司;三氟乙酸(TFA) 色譜純,德國Merck公司;正丁醇 分析純,上海麥恪林生化科技有限公司;MgO、硼酸、鹽酸、甲基紅、亞甲基藍、雙乙酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司;新鮮豬肉 江蘇省南京市蘇果超市雨潤冷鮮肉專柜。

SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇凈集團安泰公司;高壓蒸氣滅菌鍋 日本TOMY公司;WH-3微型旋渦混合儀 上海瀘西分析儀器廠有限公司;隔水式電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠;Milli-Q Academic型超純水系統 美國Millipore公司;飛鴿牌系列離心機 上海安亭科學儀器廠;游標卡尺 上海恒量量具有限公司;UV-2450分光光度計 Shimadzu公司;GXZ-9240 MBE鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;UltiMate3000戴安高效液相色譜儀 戴安中國有限公司;ARTP-Ⅱ等離子體誘變儀 無錫源清天木生物科技有限公司;Orion* 3-Star型pH計 美國Thermo公司(上海)。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌JL-A65 ARTP誘變研究

1.2.1.1 菌懸液的準備與ARTP誘變處理 將植物乳桿菌JL-A65接種于新鮮MRS培養基中(1%,v/v),37 ℃靜置培養12 h,5000 r/min,5 min離心去除培養基,用生理鹽水復溶,采用紫外分光光度計測定OD值,調節OD值至0.6～0.8。將ARTP處理儀專用的載片在酒精燈上灼燒滅菌,冷卻后取調節好OD值的10 μL菌液,均勻涂在載片上面,用鑷子夾取載片放置于等離子誘變儀的載片凹槽之中。

參數設置為:載氣:高純氦氣(99.999%);入射功率:200 W;載氣流速:10 SLM;處理溫度:25 ℃;反射功率:40 W;載物臺與放射源距離:10.0 mm;照射時間分別為15、30、45、60、75、90和105 s進行誘變,誘變處理結束后,將載片置于裝有1 mL生理鹽水的離心管中,用渦旋振蕩儀清洗2 min,將載片上面的菌液全部洗脫,將得到的菌懸液稀釋到合適的梯度(10-5～10-6)，涂布于固體MRS平板上,以未經ARTP處理的樣品作對照,每個處理涂3塊平板。37 ℃靜止培養36 h。觀察15～105 s照射時間對致死率的影響。

致死率(%)=(B-A)/B×100

式(1)

式中:A為ARTP誘變處理組平板上的菌落數;B為未經ARTP誘變處理的出發菌株平板上的菌落數。

1.2.1.2 利用瓊脂擴散法初篩 挑選合適的稀釋度,將靜止培養的平板上的單菌落用牙簽挑于裝有MRS培養基的離心管中,靜止發酵48 h,5000 r/min,5 min離心,取上清液,利用瓊脂擴散法,在大腸桿菌平板上進行抑菌實驗,以抑菌圈大小為指標,對誘變處理后菌株進行初次篩選。

1.2.1.3 誘變菌株復篩與細菌素產量提高率的計算 將初次篩選所得菌株接種于新鮮的MRS培養基,每隔12 h,轉接至新鮮的MRS培養基中,連續轉接三次之后,靜置發酵48 h,離心取上清液以瓊脂擴散法進行篩選。將篩選后抑菌效果好的菌株活化,接種于100 mL MRS培養基中,發酵48 h,取1 mL發酵液,5000 r/min離心5 min,以1.5倍發酵液體積的正丁醇萃取,將萃取后溶液用0.22 μm的濾膜過濾。利用HPLC檢測,計算相對于出發菌株的細菌素產量提高率。

液相檢測使用色譜柱為:COSMOSIL 5C18-AR-II(4.6 mm×250 mm,日本Nacalai Tesque公司);液相紫外檢測波長為231 nm;進樣20 μL;流速:0.5 mL/min;洗脫條件為:流動相為5%的乙腈(0.1%三氟乙酸)與95%的水(0.1%三氟乙酸),洗脫時間為15 min。產量與峰面積的關系為:

細菌素產量Y(mg/mL)=28.248 X+6.4541

式(2)

式中:Y為菌株細菌素產量,mg/mL;X為峰面積。

細菌素產量提高率(%)=(B-A)/B×100

式(3)

式中:A為出發菌株細菌素產量,mg/mL;B為誘變菌株細菌素產量,mg/mL。

1.2.2 植物乳桿菌JL-A65 MNNG誘變研究

1.2.2.1 誘變條件的確定 菌懸液的制備同1.2.1.1,在處理好的菌液中加入預先配制好的MNNG溶液,使得混合液中MNNG的終濃度為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 mg/mL,用渦旋儀混合完全后置于37 ℃水浴鍋中保溫10 min,之后將菌液5000 r/min,5 min離心,用生理鹽水清洗2次,復溶于生理鹽水中,將菌懸液稀釋到合適的梯度(10-5～10-6),涂布于固體MRS平板上,37 ℃靜止培養36 h。觀察0.5～4 mg/mL MNNG對致死率的影響。

1.2.2.2 利用瓊脂擴散法初篩 方法同1.2.1.2。

1.2.2.3 誘變菌株復篩與HPLC檢測 方法同1.2.1.3。

1.2.3 植物乳桿菌JL-A65基因組改組研究

1.2.3.1 原生質體制備條件 將前期誘變篩選得到的突變菌株過夜培養后,轉接于(接種量為5%)50 mL的MRS培養基中,37 ℃,靜置培養。培養8 h后取10 mL培養液,離心(4000 r/min,5 min)收集菌體,LPB緩沖液洗滌2次后重懸于LPB中,加入溶菌酶使終濃度為25 mg/mL,37 ℃水浴處理20 min,LPB洗滌兩次(2000 r/min,15 min),稀釋后分別涂布于普通MRS平板和再生平板,之后固定溶菌酶濃度、水浴溫度和處理時間,分別于4、6、8和10 h后各取10 mL培養液;固定培養時間、水浴溫度和時間,調節溶菌酶濃度分別15、20、25、30和35 mg/mL;固定培養時間、溶菌酶濃度與水浴時間,水浴溫度分別為31、34、37和40 ℃;固定培養時間、溶菌酶溫度和水浴溫度,水浴處理10、20、30、40和50 min。其他步驟不變。計算原生質體形成率和原生質體再生率,確定原生質體的制備條件。

原生質體形成率的測定:將酶解前的菌懸液和酶解后的原生質體液梯度稀釋,涂布于普通MRS培養基上。37 ℃培養36 h,計算菌落數,計算原生質體形成率。

原生質體形成率(%)=(A-B)/A×100

式(4)

式中:A為酶解前的總菌落數;B為未原生質體化的菌落數。

原生質體再生率的測定:用緩沖液稀釋酶解后的原生質體液,取原生質體液涂布于再生培養基平板上,置于37 ℃培養箱中，倒置培養36 h,觀察再生菌落的形態并計數。

原生質體再生率(%)=(C-B)/(A-B)×100

式(5)

式中:A為總菌落數;B為未形成原生質體的菌落數;C為再生菌落數。

1.2.3.2 原生質體滅活條件 紫外滅活:取一管上述制備好的原生質體菌懸液置于直徑為6 cm的玻璃培養皿中,平皿中放入磁力針做轉子，并置于磁力攪拌器上,將磁力攪拌器置于超凈臺中,調整照射距離19.5 cm,照射時間為10、15、20、25、30和35 min,分別取原生質體滅活后的溶液,于避光條件下取100 μL涂布于再生平板上,避光培養36 h后計數菌落數,計算滅活率。

熱滅活:將另一管上述制備好的原生質體液移入離心管中,置于60 ℃水浴中計時。分別于15、20、25、30、35、40和45 min時，各取原生質體溶液100 μL,涂布于再生平板上。避光培養36 h后計數菌落數,計算滅活率。

原生質體滅活率(%)=(C-B-D)/(C-B)×100

式(6)

式中:D為經滅活處理的原生質體液在再生固體平板上的菌落數;B為未形成原生質體的菌落數;C為再生菌落數。

1.2.3.3 原生質體融合條件 將上述紫外滅活和熱滅活后的原生質體各取500 μL等量混合,3000 r/min低速離心20 min,棄上清液,重懸于500 μL LPB中,加9倍體積的不同體積分數(30%、40%、50%和60%)的PEG 6000,室溫下作用15 min;加9倍體積的體積分數40%的PEG 6000,在室溫下作用不同時間(10、15、20和25 min),作用時間結束后,立即加5 mL LPB稀釋,去除PEG 6000的作用,然后3000 r/min低速離心洗滌兩次,重懸于100 μL LPB緩沖液中。將融合后的原生質體溶液稀釋不同倍數,涂于再生平板,37 ℃培養箱培養48 h。以未經滅活的原生質體液涂布再生平板,作為對照，確定原生質體融合條件。

原生質體融合率的計算:融合率(%)=R/(C-B)×100

式(7)

式中:R為融合后再生平板上的菌落數;B為未形成原生質體的菌落數;C為再生菌落數。

1.2.4 細菌素plantaricin JL-A65在肉制品中的應用

1.2.4.1 生鮮肉處理 在超凈臺中將購買的肉泥分為5組每組800 g,分別添加不同劑量的復配防腐劑,攪拌均勻后進行成形分裝,將分裝好的樣品進行編號,放入4 ℃冰箱中進行儲藏,每2 d取一次樣。不同處理分組為：L0:對照組,不添加任何物質;L1:0.5 g/kg雙乙酸鈉+8 mg/kg細菌素;L2:1.0 g/kg雙乙酸鈉+16 mg/kg細菌素;L3:1.5 g/kg雙乙酸鈉+24 mg/kg細菌素;L4:2.0 g/kg雙乙酸鈉+32 mg/kg細菌素。

1.2.4.2 測定項目 菌落總數的測定:參照GB 4789.2-2010《菌落總數測定》。揮發性鹽基氮(TVB-N)和pH的測定:TVB-N按照GB/T5009.44-2003《肉與肉質品衛生標準的分析方法》中半微量定氮法進行測定。取10 g樣品加入100 mL的煮沸冷卻后的蒸餾水浸提30 min,過濾后濾液經校正劑校正后，用pH計測定pH。

1.3 數據處理

所有數據都做三組平行實驗。數據采用Excel進行分析,計算平均值與標準差。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌JL-A65 ARTP誘變研究

2.1.1 植物乳桿菌JL-A65 ARTP誘變條件的確定 由圖1可知,植物乳桿菌JL-A65致死率隨著誘變時間的增加而上升,ARTP誘變處理時間為30 s時，致死率為70%,ARTP誘變處理時間為45 s時,致死率為93%,ARTP誘變處理時間為105 s時,致死率達到了100%。研究表明，致死率為80%～90%時,正突變率較高[22]。所以結合實驗結果,選擇后續實驗處理時間為40 s。

圖1 植物乳桿菌JL-A65 ARTP誘變致死率曲線Fig.1 The fatality rate curve of L. plantarumJL-A65 after ARTP mutagenesis

2.1.2 植物乳桿菌JL-A65 ARTP誘變初篩及復篩 以發酵液對大腸桿菌的抑菌圈大小為指標,共對1538株誘變處理菌進行了初篩,有165株菌的抑菌效果較好。將初次篩選所得菌株接種于新鮮的培養基中,連續轉接三代,測定發酵液對大腸桿菌的抑菌圈,仍然有16株菌的發酵液抑菌效果比出發菌好,將突變株活化發酵,上清液萃取后利用HPLC檢測,計算細菌素產量提高率(見圖2)。

圖2 ARTP誘變對植物乳桿菌JL-A65細菌素產量的影響Fig.2 The effect of ARTP mutagenesis on bacteriocin production by L. plantarum JL-A65

從圖2可以看出，菌株A7-10和A8-110共2株菌發酵液抑菌效果較好。細菌素產量提高率分別為45.1%和48.9%。王興吉等[23]利用ARTP誘變使突變株產中溫α-淀粉酶活力提高了32.2%,王耀耀等[24]利用ARTP誘變使突變株那他霉發酵效價提高了32.5%。菌株A7-10和A8-110細菌素產量提高較高,可以作為親本庫進行下一步融合。

2.2 植物乳桿菌JL-A65 MNNG誘變研究

2.2.1 植物乳桿菌JL-A65 MNNG誘變條件的確定 從圖3中可以看出，植物乳桿菌JL-A65致死率隨著MNNG濃度的增高而上升,0.5 mg/mL的MNNG處理后致死率為53%,2 mg/mL的MNNG處理后,致死率上升到了90%,MNNG濃度為4 mg/mL時,致死率達到100%。相關研究致死率為80%～90%時,正突變率較高[25-26],最后決定MNNG誘變濃度為1.5 mg/mL。

圖3 植物乳桿菌JL-A65 MNNG誘變致死率曲線Fig.3 The fatality rate curve of L. plantarum JL-A65 after MNNG mutagenesis

2.2.2 植物乳桿菌JL-A65 MNNG誘變初篩及復篩 以發酵液對大腸桿菌的抑菌圈大小為指標,總共對964株誘變菌進行了初篩,有120株菌的抑菌效果較好。對初次篩選所得菌株,連續轉接三代,在大腸桿菌平板上測定發酵液的抑菌圈,仍然有15株菌抑菌效果較好。將抑菌效果好的菌株活化發酵,上清液萃取后用液相檢測,計算細菌素產量提高率(見圖4)。

圖4 MNNG誘變對植物乳桿菌JL-A65細菌素產量的影響Fig.4 Effect of MNNG mutagenesis on bacteriocin productionby L. plantarum JL-A65

從圖4中可以看出，M2-58和M7-111共2株菌產量提高較多,細菌素產量提高率分別為46.6%和31.3%。Yin等[25]利用亞硝基胍誘變突變株谷胱甘肽產量提高了41.8%。丁琳[26]利用亞硝基胍誘變使突變株產林肯霉素相對效價提高了35.4%。M2-58和M7-111細菌素產量提高較多,可以作為親本庫進行下一步融合。

2.3 植物乳桿菌JL-A65基因組改組研究

2.3.1 原生質體制備條件 從圖5A可以看出,當培養至8 h時，原生質體形成率達到93.71%,原生質體形成率較高,當培養至8 h時,原生質體再生率達到51.61%。從圖5B可以看出,酶濃度在15～35 mg/mL的濃度范圍內,原生質體形成率均保持在80%以上的形成率,而當酶濃度為25%時,原生質體再生率達到最大值58.57%。從圖5C可以看出,原生質體形成率與再生率均隨著酶解溫度的延長呈現上升的趨勢,當溫度達到37 ℃時,原生質體形成率與再生率達到最大值,然后隨著溫度的升高,呈現下降的趨勢。從圖5D可以看出,當酶解時間在30 min時，原生質體形成率與再生率達到最大值。

圖5 不同條件對原生質體制備的影響Fig.5 Effect of different conditions on protoplast preparation

根據實驗結果,選擇接種后8 h處于對數生長中后期的菌液,使用25 mg/mL的溶菌酶37 ℃下處理30 min,原生質體形成率為90%以上,再生率為50%以上。

2.3.2 原生質體滅活條件 從圖6可以看出,紫外滅活至30 min時,原生質體達到100%的滅活,而為使植物乳桿菌徹底滅活,延長5 min滅活時間,以35 min作為紫外滅活的時間。而當熱滅活時間達到40 min,滅活率達到了100%,同樣為了使植物乳桿菌徹底滅活,將滅活時間延長5 min,以45 min作為熱滅活的時間。

圖6 不同處理對原生質體滅活的影響Fig.6 Effect of different treatment on protoplast inactivation

2.3.3 原生質體融合條件 從圖7和圖8中可以看出,當PEG6000濃度為40%時,原生質體融合率最高,為30%。當融合時間為20 min時,融合率最高,為29%。

圖7 PEG濃度對原生質體融合率的影響Fig.7 Effect of different PEG concentration on fusion rate

圖8 融合時間對原生質體融合率的影響Fig.8 Effect of different fusion time on fusion rate

2.3.4 融合子的篩選 利用經過誘變的初步高產菌株,經過上述融合條件后進行融合子的篩選,經過幾輪遞推式融合后,得到菌株F4-23,將高產菌株發酵液用高效液相檢測,檢測結果如圖9,細菌素產量為413 mg/L,較原始菌株提高103.48%。經過5次傳代培養后，細菌素產量無顯著差異(p>0.05)。Zhang等[27]利用基因組重組使突變株nisin產量提高了140%,賈銳等[28]利用基因組重組使突變株地衣芽孢桿菌肽產量提高了70%。菌株L4-23細菌素產量提高較多，可用作植物乳桿菌素的高產菌株。

圖9 融合菌株F4-23細菌素產量的HPLC檢測圖Fig.9 HPLC detection of bacteriocin productionby fusion strain F4-23

2.4 細菌素plantaricin JL-A65對肉丸的防腐保鮮作用

經過誘變與基因組改組,提高了細菌素的產量,之后將細菌素與雙乙酸鈉復配后添加于肉丸中,研究細菌素對肉制品的防腐保鮮效果。

2.4.1 不同防腐處理對肉丸中菌落總數的影響 由圖10中可以看出,在4 ℃儲藏條件下,各組間的菌落總數均呈現增加的趨勢,菌落總數的判定標準:新鮮肉菌落數為104CFU/g、次鮮肉為104～106CFU/g、變質肉為106CFU/g以上。對照組在第4 d左右菌落數達到4.0 log CFU/g,成為二級鮮肉,在第8 d時菌落總數已經超過6.0 log CFU/g,開始腐敗,對照組的保質期約為6 d。L1組在第8 d左右達到6.0 log CFU/g成為腐敗肉,保質期保持在6 d左右。L2、L3和L4組在第11 d左右菌落總數達到6.0 log CFU/g,開始腐敗，保質期為11 d左右，比對照組延長了5 d。

圖10 4 ℃儲藏條件下不同防腐處理對肉丸中菌落總數的影響Fig.10 Effects of different treatment of total bacterial counts for meatball during storage at 4 ℃注:L0:對照組;L1:0.5 g/kg雙乙酸鈉+8 mg/kg細菌素;L2:1.0 g/kg雙乙酸鈉+16 mg/kg細菌素;L3:1.5 g/kg雙乙酸鈉+24 mg/kg細菌素;L4:2.0 g/kg雙乙酸鈉+32 mg/kg細菌素。圖11～圖12同。

2.4.2 不同防腐處理對肉丸中TVB-N的影響 根據圖11可以看出,在4 ℃儲藏期間各組的TVB-N值均隨著儲藏時間的延長呈現上升的趨勢。揮發性鹽基氮的判定標準:一級鮮肉TVB-N值≤15 mg/100 g;次鮮肉15 mg/100 g20 mg/100 g。在儲藏至4 d時，對照組TVB-N開始出現明顯的變化,到第6 d左右時已經超過15 mg/100 g,第8 d時接近20 mg/100 g，肉丸已經開始腐敗。L1組與對照組在儲藏期間的TVB-N值基本一致,L2、L3和L4組TVB-N值在第12 d左右達到20 mg/100 g，肉丸已經開始腐敗。

圖11 4 ℃儲藏條件下不同防腐處理對肉丸TVB-N的影響Fig.11 Effects of different treatment for TVB-N values of meatball during storage at 4 ℃

2.4.3 不同防腐處理對肉丸pH的影響 由圖12中可以看出,在4 ℃儲藏期間各組的pH均呈現上升趨勢,對照組及L1組變化幅度較大,而L2、L3和L4組變化相對較小,pH的判定標準為:新鮮肉pH5.8～6.2;次鮮肉pH6.3～6.6;變質肉pH>6.7。在14 d的儲藏時期內,對照組在第6 d時,pH接近6.4,達到腐敗肉標準,而L1組在第12 d時，pH接近6.4,L2、L3和L4組在第14 d時,pH接近6.4,較對照組保藏期延長至12 d。

圖12 4 ℃儲藏條件下不同防腐處理對肉丸pH的影響Fig.12 Effects of different treatment for pH values of meatball during storage at 4 ℃

綜合來看,當復配劑的使用量大于1.0 g/kg雙乙酸鈉+16 mg/kg細菌素時,可以明顯地抑制肉制品腐敗,使肉丸的保藏期從6 d延長到11 d。這與Zhang等[29]和時威[30]的研究結果相近,Jinlan Zhang將Pentocin 31-1添加到了冷藏豬肉中,使保藏期從6 d延長到了15 d。時威將類細菌素粗提物添加到冷藏豬肉中,使保藏期從7 d延長到15 d。

3 結論

本文采用等離子誘變和甲基硝基亞硝基胍誘變兩種方式,篩選得到了A7-10、A8-110、M2-58和M7-111共4株菌，其發酵液的抑菌效果較好。細菌素產量較原始菌株分別提高45.1%、48.9%、46.6%和31.3%。經過4輪遞推式融合最終得到一株突變株F4-23,細菌素產量較原始菌株提高103.48%。當復配劑的使用量大于1.0 g/kg雙乙酸鈉+16 mg/kg細菌素時,可以明顯地抑制肉制品腐敗,使肉丸的保質期從6 d延長到11 d。實驗表明,理化誘變結合基因組改組可以快速篩選到細菌素高產菌株,細菌素對肉丸具有較好的防腐保鮮效果。