一株乳酸明串珠菌的鑒定及抑菌培養基配方優化

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(錦州醫科大學,食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

內蒙古傳統發酵乳制品馬奶酒屬于傳統的自然發酵,其在發酵過程中富含各種乳酸菌,在醫療與保健方面有著明顯的作用[1]。其中乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)對多種病原微生物具有抑制作用,因為該菌在代謝過程中會合成細菌素,可以被應用于生物防治或添加劑等方面[2]。

近些年來，許多學者都試圖探究馬奶酒中乳酸菌及其代謝產物的特性,期望可以在食品保鮮、醫療保健等方面能廣泛應用,例如熊駿等[3]從豆豉中篩選到一株具有高效抑菌活性的植物乳桿菌,并對其抑菌機制進行研究,發現其具有新型生物保鮮劑的潛力;雷趙民等[4]研究發現了五株具有抑菌活性的乳酸菌，均能明顯改善青貯飼料發酵品質。現階段,乳酸菌代謝產物產量較低,分離成本較高,為了工業化生產及應用,通過優化乳酸明串珠菌產抑菌物質的培養基配方,能夠提高其產量。

本研究以內蒙古馬奶酒中的一株抑菌性能方面的優勢乳酸菌為研究對象,對其進行16S rRNA基因序列分析,并對該菌株抑制枯草芽孢桿菌抑菌性能的培養基配方進行優化,以便于提高該菌株代謝產生抑菌物質的能力,為該菌株在工業化應用方面提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌株 試驗室前期分離保存,GEN BANK注冊號為KP408150;枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501 由錦州醫科大學微生物試驗室提供;MRS培養基 酵母粉、牛肉膏、果糖、木糖和吐溫80等 杭州濱和微生物試劑有限公司;蛋白Marker、RNA Marker、引物等 寶生物工程有限公司，均為分析純。

Takara 16S rRNA PCR儀 寶生物工程有限公司;MBMJ-78A高壓蒸汽滅菌鍋 廣州華創醫療器械有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機 上海圣科儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌株的活化 將已純化并凍存于甘油中的菌株從-80 ℃冰箱中取出,恢復室溫后,吸取100 μL接種于MRS培養基中,37 ℃培養24 h,如此連續活化3代。

1.2.2 菌株16S rRNA基因序列分析 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株DNA,采用16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增[5]。對擴增后的產物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測,由寶生物(大連)工程有限公司測序。將測序結果在NCBI數據庫中對比分析[6],相似性在98%以上可認為是同一種。利用軟件MEGA 5.0構建系統發育樹進行分析。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 不同碳源對抑菌效果的影響 培養基初始pH均為6.5,接種量為2%,溫度為37 ℃,培養24 h。以葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖分別作為培養基中唯一的碳源[7],對照組不添加碳源,其中碳源添加量為20 g/L,其他培養基成分添加量為普通蛋白胨10 g/L,無水CH3COONa 5 g/L,K2HPO42 g/L,牛肉粉5 g/L,吐溫80 1 mL/L,C6H17N3O72 g/L,MnSO40.05 g/L,MgSO40.2 g/L,蒸餾水1 L。采用枯草芽孢桿菌為指示菌,通過牛津杯瓊脂擴散法進行抑菌試驗,測定抑菌圈,根據抑菌圈直徑大小確定出最佳碳源。

1.2.3.2 不同氮源對抑菌效果的影響 在最佳碳源的基礎上,氮源分別為大豆蛋白胨、普通蛋白胨、氯化銨、胰蛋白胨、硫酸銨和酪蛋白胨,添加量為10 g/L,對照組則不添加氮源,其它實驗條件同1.2.3.1,進一步研究不同氮源對抑菌圈直徑大小的影響。

1.2.4 Plackett-Burman試驗 根據乳酸菌生長所需營養要素的基本原則,結合以上單因素實驗的結果,選取8個影響因素進行試驗。利用Minitab軟件通過Plackett-Burman試驗[8],從而篩選出對乳酸明串珠菌抑菌性影響最為顯著的因素。

1.2.5 最陡爬坡實驗 根據前期Plackett-Burman實驗的結果,確定出各因素的顯著性,并明確各顯著因素的正負效應,然后設計最陡爬坡實驗,根據PB實驗結果回歸方程系數,確定步長為0.5 (g/L),根據各因素正負效應確定變化方向[9]。

1.2.6 Box-Behnken試驗 根據Plackett-Burman試驗設計結果,發現蔗糖、蛋白胨、無水乙酸鈉對于抑菌圈直徑的影響最大,因此以抑菌圈直徑作為響應值Y,X1為蔗糖、X2為蛋白胨、X3為無水乙酸鈉,進行Box-Behnken試驗,最終得到的試驗結果用Design Expert進行回歸分析[10-11]。為了驗證得到的方程模型的準確性,按照最優培養基的配方,對乳酸明串珠菌進行培養,然后通過牛津杯瓊脂擴散法進行抑菌試驗,重復三次,最終結果取三次的平均值。

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment

表2 Box-Behnken試驗因素及水平表Table 2 Factors and levels table of Box-Behnken experiment

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定結果

將活化后的菌株接種在MRS培養基上,37 ℃培養24～48 h后,可在培養皿上看到乳白色、表面光滑、有光澤、質地均勻、邊緣齊整、活性強的圓形菌落,菌落大小約在0.5～3 mm之間,該菌株革蘭染色結果為G+。對該菌株進行16S rRNA序列分析,采用MEGA構建系統發育樹,如圖1所示,可發現菌株SMN2-1-2與LeuconostoclactisJCM 6123位置最近,16S rRNA基因相似性達到98%,確定該菌株屬于乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)。

圖1 系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree

2.2 培養基配方單因素實驗結果

2.2.1 不同的碳源對抑菌效果的影響 由圖2可知,添加不同的碳源對乳酸明串珠菌抑菌性的影響不同,原因可能是不同的碳源在利用時,需要產生不同的酶類來催化反應,此外,不同的碳源對發酵產物的合成可能產生不同的作用。從圖2中可以看出,當使用蔗糖作為碳源時,抑菌圈直徑達到最大,最大可達24.3 mm,且與其他組相比,差異顯著(p<0.05),因此,蔗糖被確定為最佳碳源。

圖2 不同碳源對抑菌圈直徑的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on inhibition zone diameter注:相同字母表示差異不顯著(p>0.05),不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖3同。

2.2.2 不同的氮源對抑圈效果的影響 以蔗糖為碳源,將氮源分別替換為大豆蛋白胨、普通蛋白胨、氯化銨、胰蛋白胨、硫酸銨和酪蛋白胨,進行抑菌試驗,結果如圖3所示,當選用的氮源不同時,所測得的抑菌圈直徑明顯不同,其中當使用蛋白胨作為氮源進行試驗時,抑菌圈直徑達到最大,最大可達24.8 mm,且與其他組相比,差異顯著(p<0.05),其次,效果較好的為硫酸銨與氯化銨,考慮到價格、來源等問題,將氮源確定為蛋白胨。

圖3 不同氮源對抑菌圈直徑的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on inhibitory zone diameter

2.2.3 Plackett-Burman試驗結果 根據前期的單因素試驗結果,采用蔗糖為最佳碳源,蛋白胨為最佳氮源,設計Plackett-Burman試驗,分析8個因素對于抑菌圈直徑所產生的影響。試驗設計與結果見表3。用Y來表示抑菌圈直徑,則回歸方程為Y=10.01+0.3716A+0.2832B+1.566C+0.247D-0.579E-0.573F+4.93G-5.30H,R2=0.9863,說明回歸方程的擬合程度較好。根據試驗結果及回歸分析表4可得出,因素為A(蔗糖)對抑菌圈直徑影響極顯著(p<0.01),因素B(蛋白胨)、E(無水乙酸鈉)對抑菌圈直徑影響顯著(p<0.05),其可信度在95%的置信區間內,其它因素影響不顯著。根據回歸方程系數的正負發現因素E(無水乙酸鈉)、F(檸檬酸三銨)、H(硫酸錳)對抑菌圈直徑的影響為負效應,其它因素為正效應。因此,后續實驗因素E、F、H采用表1低水平中的值,即無水CH3COONa 4 g/L,檸檬酸三銨2 g/L,MgSO40.2 g/L,其它因素采用表1高水平中的值,即蔗糖24 g/L,蛋白胨12 g/L,K2HPO42 g/L,牛肉粉5 g/L,吐溫80 1 ml/L,C6H17N3O72 g/L,MnSO40.05 g/L,MgSO40.2 g/L。本實驗最終選擇A、B、E三個因素,進行爬坡實驗,篩選出顯著性因素的最佳濃度梯度。

表3 Plackett-Burman試驗結果Table 3 The results of Plackett-Burman experimental design

表4 Plackett-Burman試驗回歸分析Table 4 Regression analysis table of Plackett-Burman design

2.2.4 最陡爬坡實驗 以A、B、E三個因素作為影響因素,設計進行最陡爬坡實驗,實驗設計及結果如表5,根據上述Plackett-Burman實驗中回歸方程系數確定步長,當蛋白胨的添加量為12 g/L、蔗糖添加量為24 g/L、乙酸鈉的添加量為4 g/L時,此時的抑菌圈直徑最大,以此條件為Box-Behnken實驗設計的中心點,然后進行響應面分析。

表5 最陡爬坡實驗結果Table 5 Experimental results of the steepest ascent path

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis for regression equation

表6 Box-behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiment

圖4是由上述回歸方程所得到的三維空間響應面圖,分別反應了蔗糖、蛋白胨、無水乙酸鈉這三種因素兩兩交互作用對抑菌圈直徑的影響。響應面圖的坡度越陡,說明交互作用對抑菌圈直徑的影響越顯著。回歸方程中二次項系數為負值時,說明拋物線開口是向下的,也就是說該方程有極大值點。利用Design Expert進行分析計算后,可得最佳培養基配方為:蔗糖添加量為24.83 g/L,蛋白胨添加量為12.72 g/L,無水乙酸鈉的添加量為3.95 g/L,按此條件進行試驗時,預測得到的抑菌圈最大直徑為23.60 mm。

圖4 交互作用的響應面圖Fig.4 Response surface diagram of interaction

為了充分驗證利用響應法所得預測值的可靠性,采用優化后的配方,進行驗證性的抑菌試驗,重復三次,對得到的抑菌圈直徑求平均值,其平均值為(23.40±1.28) mm,與優化前的抑菌圈直徑11.2 mm相比,提高了2.1倍,與預測值基本一致，說明該試驗方案具有一定的實踐價值。

3 結論

本試驗首先對從馬奶酒中篩選出的一株具有抑菌性能的菌株進行了鑒定,確定菌株為乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)。最終確定的優化培養基配方為:蔗糖為24.84 g/L,蛋白胨12.72 g/L,無水CH3COONa 3.95 g/L,K2HPO42 g/L,吐溫80為1 ml/L,牛肉粉5 g/L,C6H17N3O72 g/L,MgSO40.2 g/L,MnSO40.05 g/L,蒸餾水1 L,經過培養基優化后,抑菌圈直徑達到了(23.40±1.28) mm,比初始抑菌圈直徑大小提高了2.1倍。進行了驗證試驗后,證明了模型是可靠的、合理的,為該菌株的進一步研究以及將來在工業化方面的應用提供了切實可信的理論依據。