酶輔助超聲法提取黑種草總皂苷的工藝優(yōu)化

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(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830046;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,新疆烏魯木齊 830004)

維吾爾藥黑種草子,維吾爾語名“斯亞旦”[1],蒙古名叫“哈日-孜拉”,傣語稱“景郎”,為毛茛科(Raunnculaceae)黑種草屬(Nigella)植物瘤果黑種草(NigellaglanduliferaFreyn et Sint)的干燥成熟種子,主要栽培種植于新疆南疆地區(qū),收載于各版《中國藥典》、《維吾爾藥志》等醫(yī)藥文獻中。目前,黑種草中已分離出十多種皂苷,具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗惡性腫瘤[4]、降糖[5]、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛[6]及祛痰[7]等多種活性作用,具有一定的開發(fā)價值。

由于黑種草子含有大量的淀粉纖維素等大分子物質(zhì),一般的有機溶劑無法使細胞壁破裂,可能會影響皂苷的提取效率。而利用酶的專一性和高效性可使細胞壁破裂、疏松,被淀粉、纖維素等大分子包裹的有效成分釋放出來,從而減少傳質(zhì)阻力,提高提取效率[8]。超聲輔助提取法是利用超聲波的強烈震動、強烈的空化效應(yīng)、攪拌等作用,將植物細胞破壞之后使溶劑直接進入細胞中,從而促進提取成分在溶劑中的溶解[9]。酶輔助超聲提取法結(jié)合了酶法和超聲提取法優(yōu)點,不僅提取時間短、得率高,并且能很好地保持提取物的特性和品質(zhì)[9],廣泛應(yīng)用于中草藥活性成分的提取。目前已有加熱回流法[10]和超聲輔助提取法[11]提取黑種草總皂苷的報道,但得率不高。

本文采用酶輔助超聲法提取黑種草總皂苷,以黑種草總皂苷得率為考察指標(biāo),通過單因素實驗和響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝參數(shù),以期為黑種草資源的綜合開發(fā)、利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑種草藥材 新疆烏魯木齊市二道橋藥材市場;黑種草皂苷A對照品 純度≥98%,新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所值化室制備;無水乙醇 天津市富宇精細化工有限公司;香草醛 天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司;硫酸 永清縣永飛化學(xué)試劑有限公司;纖維素酶(≥40 U/mg)、半纖維素酶(≥10 U/mg)、果膠酶(≥30 U/mg)、高溫淀粉酶(≈30 U/mg) 如吉生物科技;B-廣范試紙 中國·上海三愛思試劑有限公司。

WV-754型紫外分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;AS10200AD型超聲清洗機 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;Bp211D型電子天平 德國Sartorius有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑種草總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻[10]采用硫酸-香草醛-無水乙醇法繪制黑種草皂苷A標(biāo)準(zhǔn)曲線。以黑種草皂苷A標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mg)為橫坐標(biāo),測定的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到黑種草皂苷A標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.0096c-0.0473,r=0.9971,檢測線性范圍為49.78～132.75 μg/mg。

1.2.2 黑種草總皂苷的提取 稱取脫脂、粉碎并過40目篩的黑種草1 g,放入錐形瓶中,在一定酶、溫度和時間下進行超聲處理,中途不斷攪拌。用濾紙過濾,取上清液檢測,將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出溶液中總皂苷濃度,按下列公式計算黑種草總皂苷得率:

式中:W表示總皂苷得率,%;c表示根據(jù)吸光度值計算出的溶液質(zhì)量濃度,mg/mL;D表示溶液稀釋倍數(shù);V表示供試品溶液體積,mL;m表示藥材取樣量,mg。

1.2.3 酶制劑的選擇 稱取4份1.0 g脫脂黑種草,分別向其中加入占原料質(zhì)量1%的纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、高溫淀粉酶,將一份未加任何酶制劑的樣品作對照組。每份樣品分別加50倍量30%乙醇,加入鹽酸緩沖液,改變pH,pH分別設(shè)定3、4、5、6,將上述各組樣品于60 ℃,超聲頻率12 kHz下超聲30 min,酶解后,各組樣品經(jīng)滅酶(沸水浴5 min),過濾得到上清液。分別從各組中取適量提取液,計算黑種草皂苷得率。

1.2.4 單因素實驗 采用1.2.2方法提取黑種草總皂苷,固定實驗條件為提取液溫度為60 ℃、超聲波頻率為12 kHz、超聲處理30 min、乙醇濃度為30%、乙醇溶劑為50 mL、酶添加量為1%。分別考察各單因素酶添加量(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)、乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%),料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL),超聲時間(10、20、30、40、50 min)、超聲頻率(12、24、36、48、60 kHz)、溫度(30、40、50、60、70 ℃)對黑種草總皂苷得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上選取酶添加量、酶解溫度、料液比、乙醇濃度4個因素為考察因素自變量,以黑種草總皂苷得率(Y)為響應(yīng)值,根據(jù)中心組合試驗設(shè)計(central composite design,CCD)原理[12-14],設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝,以-1、0、1編碼分別代表自變量低、中、高水平,因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析,Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑的篩選結(jié)果

如圖1所示,不同種酶在不同pH的條件下,所得總皂苷得率也不相同。隨著pH的增加,不同種酶的總皂苷得率均增加,當(dāng)pH等于6時,半纖維素>果膠酶>淀粉酶>纖維素酶>無酶。原液的pH為6.5,從經(jīng)濟性和操作性考慮,不改變pH,選擇半纖維素酶進行接下來的試驗。

圖1 酶制劑對總皂苷得率的影響Fig.1 Effect of enzyme preparationon the total saponin extraction rate注:與無酶相比,**表示差異極顯著(p<0.01)。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 酶添加量對總皂苷得率的影響 如圖2所示,酶添加量為0.6%～1.0%時，隨著酶添加量的增加,總皂苷的得率緩慢增加,但當(dāng)酶添加量超過1.0%后,得率減少,推測酶添加量過多不利于總皂苷的充分溶出,而使總皂苷得率降低。為了進一步考察酶添加量對總皂苷提取效果的影響,分別選擇酶添加量占0.8%、1.0%、1.2%進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

圖2 酶添加量對總皂苷得率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosageon the total saponin extraction rate

2.2.2 乙醇濃度對總皂苷得率的影響 如圖3所示,隨著乙醇濃度的增加(30%～50%),得率不斷增加,當(dāng)乙醇濃度為50%時,總皂苷的得率最大,之后隨著乙醇濃度的增大,得率緩慢下降,可能是因為乙醇濃度越高,提取出來的雜質(zhì)越多,從而限制了總皂苷的溶出,得率逐漸下降。為了進一步考察乙醇濃度對黑種草總皂苷得率的影響,選擇乙醇濃度40%、50%、60%進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

圖3 乙醇濃度對總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the total saponin extraction rate

2.2.3 料液比對總皂苷得率的影響 如圖4所示,隨著料液比的增加(1∶10～1∶30 g/mL),得率也相應(yīng)增加,當(dāng)料液比到達1∶30 g/mL時,得率最高,但當(dāng)料液比超過1∶30 g/mL后,總皂苷得率呈現(xiàn)下降的趨勢。溶劑較少時，不能與物料充分接觸，使得總皂苷沒有充分溶出，隨著溶劑量的增加，總皂苷逐漸溶出，溶劑量過高時，溶液中總皂苷達到了飽和，得率不再增加。為了進一步考察料液比對得率的影響,選擇料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40 g/mL進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

圖4 料液比對總皂苷得率的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the total saponin extraction rate

2.2.4 酶解超聲時間對總皂苷得率的影響 如圖5所示,隨著超聲時間的增加,得率不斷的增加,當(dāng)超聲時間為30 min時,得率趨于平緩。超聲時間較短時,總皂苷溶出時間較短,溶液中總皂苷含量較低,超聲時間達到30 min時,達到總皂苷溶出的最大限度,繼續(xù)延長超聲時間，增加趨勢趨于平緩。從經(jīng)濟性考慮,選取酶解超聲時間為30 min進行接下來的試驗。

圖5 酶解超聲時間對總皂苷得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on total saponin extraction rate

2.2.5 超聲頻率對總皂苷得率的影響 如圖6所示,隨著超聲頻率的增加,總皂苷得率整體呈升高趨勢,當(dāng)超聲頻率為60 kHz時,總皂苷得率為最高。故選擇超聲頻率為60 kHz進行接下來的試驗。

圖6 超聲頻率對總皂苷得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic frequency on the total saponin extraction rate

2.2.6 酶解溫度對總皂苷得率的影響 如圖7所示,隨著酶解溫度的增加,得率不斷增加,當(dāng)酶解溫度為60 ℃時,總皂苷得率最大,當(dāng)酶解溫度超過60 ℃后,總皂苷得率反而減小,這是由于酶解溫度過高,導(dǎo)致酶活力下降,甚至造成酶活力失活,釋放不出被大分子包裹中的皂苷,導(dǎo)致總皂苷的得率降低。為了進一步考察酶解溫度對得率的影響。選擇酶解溫度分別為50、60、70 ℃進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

圖7 酶解溫度對總皂苷得率的影響Fig.7 Effect of enzymolysis temperatures on the extraction rate of total

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,采用Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理[12-14],以總皂苷得率為考察指標(biāo),選取酶解溫度A、乙醇濃度B、料液比C、酶的添加量D四個因素,進行4因素3水平響應(yīng)面試驗,試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.3.2 響應(yīng)面分析 對表3中數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到自變量與黑種草總皂苷得率(Y)的二次項回歸方程為:

Y=-33.65617+0.73313A+0.38525B+0.18115C+26.55417D+(-2.50000E-004)AB+(+1.6750E-003)AC+0.29750AD+(+3.20000E-003)BC+0.04BD-0.21750CD+(-9.31500E-003)A2+(-4.85250E-003)B2+(-3.26500E-003)C2-19.38125D2

由表3可知,模型一次項A、C、D極顯著(p<0.01),B顯著(p<0.05);二次項A2、B2、C2、D2均處于極顯著水平(p<0.01);交互項AD和CD均極顯著(p<0.01),BC為顯著(p<0.05),AB、AC、BD均不顯著(p>0.05)。在各影響因素中,酶解溫度(A)對黑種草總皂苷的影響最大,其次是料液比(C)、酶添加量(D)和乙醇濃度(B)。經(jīng)Design-Expert 8.0.6優(yōu)化,通過對回歸模型求解方程,得出黑種草酶解超聲法最佳條件為:酶解溫度57.51 ℃,乙醇濃度54.29%,料液比1∶36.54 g/mL,酶添加量0.98%,在此條件下黑種草總皂苷得率的預(yù)測值為14.17%。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

響應(yīng)面坡度越大，表明因素對響應(yīng)值影響越大,等高線密集呈橢圓形，表示兩因素交互影響大,而坡度平緩、等高線呈圓形則與之相反[15]。響應(yīng)面坡度越大,中心凸點越突出,說明該因素對黑種草總皂苷得率的影響越大[16]。從圖8a、圖8c中可以看出,AD、CD的交互作用對黑種草總皂苷的得率有顯著影響;由圖8b可知,因素B(乙醇濃度)與因素C(料液比)的交互作用對黑種草總皂苷的得率也有顯著影響,但其影響程度略弱于AD、CD。

圖8 各因素交互作用對黑種草總皂苷得率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagrain ofthe interaction of various factors on the extraction rate of total saponins of Nigella glandulifera

2.3.3 驗證試驗 為檢驗響應(yīng)面法優(yōu)化后的工藝可靠性,考慮實驗操作的可行性,以上述最佳條件為參考,選擇酶解溫度60 ℃,乙醇濃度54%,料液比1∶37 g/mL,酶添加量為0.98%,超聲頻率為60 kHz,時間為30 min,進行5組重復(fù)實驗,所得黑種草總皂苷得率均值為14.09%±0.12%,與理論值的相對誤差為0.6%,回歸方程預(yù)測值與實際值相吻合,說明運用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠,能真實地反映各因素對黑種草總皂苷得率的影響。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助超聲提取黑種草總皂苷的工藝，建立黑種草皂苷得率的二次多項數(shù)學(xué)模型。該模型極顯著(p<0.01),擬合情況較好。最佳工藝條件為:酶解溫度60 ℃,乙醇濃度54%,料液比為1∶37 g/mL,酶添加量為0.98%,此條件下黑種草總皂苷得率均值為14.09%±0.12%,總皂苷得率的預(yù)測值為14.17%,兩者相對誤差為0.6%,響應(yīng)面法優(yōu)化得到酶輔助超聲法提取黑種草總皂苷的最佳工藝,可為黑種草資源的綜合開發(fā)、利用提供一定參考。