基于聚乙二醇/水體系的菠蘿蜜果皮多糖提取及其抗氧化活性研究

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(海南大學食品學院,海南海口 570228)

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)又稱木菠蘿、樹菠蘿等,屬于桑科木菠蘿屬。被譽為“熱帶水果皇后”的菠蘿蜜是華南地區主要的熱帶水果之一。熱帶地區菠蘿蜜種植面積已經超過20萬畝[1]。在菠蘿蜜的加工和生產中,副產物果皮(約42%)多作為廢棄物丟棄[2]。廢棄果皮不僅浪費資源,還可能對環境造成破壞。菠蘿蜜果皮活性物質的研究多集中在多酚類化合物和總黃酮上[3-4]。菠蘿蜜果皮中活性物質的應用潛力和發展價值還未被充分挖掘。近年來,植物多糖因具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降血糖和抗氧化等作用成為研究熱點。而當前關于菠蘿蜜果皮多糖的研究甚少，且提取方法較為單一,主要以酸提取法為主[5-6],且存在提取時間較長、耗能高和酸堿試劑對環境造成的污染等問題。

不同于雙水相體系使用的高分子量聚乙二醇(Da≥6000)[7],低分子量(Da≤1000)的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)/水體系作為綠色溶劑,它與水和有機溶劑均有很好的相溶性,良好的生物降解能力、完全無鹵和非揮發性等優點[8-9],受到國內外研究者廣泛關注。此外,PEG/水體系在超聲波中有較好的能量耗散,且在酸性、氧化還原體系和高溫中具有較高的穩定性。因此,PEG/水體系可以作為一種安全、有效和溫和的萃取溶劑[10]。低分子量(Da≤1000)PEG/水體系已經在石榴皮和銀耳等天然產物的多糖提取中取得了較好的效果[11-13]。此外,超聲-微波協同提取法(ultrasound-microwave assisted extraction,UMAE)充分結合了微波的高能作用和超聲波的空化作用,已經廣泛應用于多糖提取上[14-15]。

本文旨在研究超聲-微波協同低分子量(Da<1000)PEG/水體系提取菠蘿蜜果皮多糖的效果,并與純水作提取溶劑進行比較分析,初步探究PEG/水體系對多糖提取效果的影響。為提取菠蘿蜜果皮多糖提供新方法,充分發揮廢棄菠蘿蜜果皮價值,探索解決食品加工中廢棄物污染問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜果皮品種 為馬來西亞1號由海南大學百果園水果市場提供;不同分子量聚乙二醇、葡萄糖分析標準品 麥克林試劑有限公司;水楊酸鈉1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 源葉生物有限公司;三氯甲烷純度≥99%、丙酮純度≥99.5%、無水乙醇純度≥99.7%、三氯化鐵純度≥99%、抗壞血酸純度≥99.7%、苯酚純度≥99%、鐵氰化鉀純度≥99.5% 西隴化工股份有限公司;所用試劑 均為分析純(AR)。

IKA A11分析用研磨機 艾卡儀器設備有限公司;CW-2000型超聲-微波協同萃取儀 上海新拓微波溶樣測試技術有限公司;FDU-2100冷凍干燥機 埃朗科(上海)國際貿易有限公司;RE-2000A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;L500型離心機 湖南湘儀有限公司;TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析有限責任公司;PL303電子天平 梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的預處理 菠蘿蜜果皮洗凈后60 ℃烘干、粉碎后過60目篩。取適量果皮粉在75 ℃下，使用80%乙醇回流5 h除去糖類雜質,于55 ℃，48 h下烘干后備用。

1.2.2 菠蘿蜜果皮多糖提取工藝 多糖提取工藝參考文獻[16]并作適當修改。萃取儀在工作模式下，超聲波頻率和功率自動固定為40 kHz和50 W。取適量果皮粉于250 mL超聲-微波協同萃取儀玻璃容器中,分別以PEG/水體系和純水作為提取溶劑,按設定條件提取菠蘿蜜果皮中的多糖。提取完成后冷卻至室溫,提取液4800 r/min離心15 min,上清液濃縮后加入4倍體積的無水乙醇(終濃度為80%),在4 ℃下靜置沉淀12 h,4000 r/min離心12 min后棄去上清液,所得沉淀用95%(v/v)乙醇和丙酮洗滌數次,冷凍干燥后得到菠蘿蜜果皮多糖JFP-P(PEG/水體系作提取溶劑)和JFP-W(純水作提取溶劑)。

1.2.3 超聲-微波協同提取菠蘿蜜果皮多糖單因素實驗 以菠蘿蜜果皮粉末為原料,分別研究PEG分子量、PEG濃度、微波功率、提取時間、料液比對多糖得率的影響。提取基本條件為:PEG-200/水體系、濃度0.3 g·mL-1、微波功率65 W、提取時間30 min、料液比1∶40 (g/mL)。各因素水平為:PEG分子量200、400、600、800 Da;PEG濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·mL-1;微波功率45、55、65、75、85 W;提取時間10、20、30、40、50 min;料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 (g/mL)。

1.2.4 響應面法試驗設計 在單因素實驗的基礎上,分別以PEG-200/水體系濃度、微波功率、提取時間和料液比為自變量,以多糖得率為響應值,采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析,對超聲-微波協同提取工藝參數進行優化,試驗因素及水平見表1。

1.2.5 菠蘿蜜果皮多糖得率的計算 以葡萄糖為標準品,采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[17]。按照下式計算菠蘿蜜果皮多糖得率:

1.2.6 菠蘿蜜果皮多糖體外抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除活性 參考Li等[18]的方法加以改進,4 mL不同濃度多糖樣品液(0.25、0.5、1.0、1.5、2 mg/mL)分別混合1 mL 0.2 mmol/L的DPPH自由基甲醇溶液,混合物在室溫下劇烈搖動后,在室溫下保持30 min,于517 nm波長測定吸光度。抗壞血酸作為陽性對照,清除活性計算如下:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A0)/A2]

式(1)

式中,A0為樣品的吸光度(不含DPPH溶液的樣品);A1為樣品液混合DPPH的吸光度;A2為DPPH溶液的吸光度。

1.2.6.2 羥基(OH)自由基清除活性 參考Sun等[19]的方法加以改進,1 mL不同濃度多糖樣品液(0.25、0.5、1.0、1.5、2 mg/mL)分別加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL,6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL,和6 mmol/L過氧化氫溶液1 mL后立即混勻,37 ℃水浴1 h,在536 nm處測定吸光度(A0),以抗壞血酸為陽性對照。

OH自由基清除率(%)=[1-(A0-A1)/A2]×100

式(2)

式中,A1為蒸餾水替代過氧化氫溶液的吸光度值,A2為蒸餾水代替多糖樣品液的吸光度值。

1.2.6.3 還原力的測定 參考Lin等[20]的方法稍作修改,1 mL不同濃度多糖樣品液(0.25、0.5、1.0、1.5、2 mg/mL)分別加入1%鐵氰化鉀1 mL和磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)1 mL,充分混勻后,50 ℃水浴20 min,加入10%三氯乙酸1 mL,5000 r/min離心10 min,收集1 mL上清液,加入蒸餾水1 mL和0.1%的氯化鐵1 mL,混合后室溫下靜置10 min,在700 nm處測定吸光度,抗壞血酸作陽性對照,蒸餾水作空白對照。

1.2.7 菠蘿蜜果皮多糖紅外光譜分析 將響應面優化工藝所得多糖JFP-P和JFP-W分別與溴化鉀固體粉末混勻,研磨后壓片,在4000～500 cm-1內進行紅外光譜掃描。

1.2.8 菠蘿蜜果皮多糖紫外光譜分析 將響應面優化工藝所得多糖JFP-P和JFP-W分別配制成1 mg/mL溶液,使用紫外分光光度計在波長200～700 nm范圍內掃描。

1.3 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6、SPSS 17.0和Origin 9.0軟件對數據進行處理分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 超聲-微波協同提取菠蘿蜜果皮多糖單因素實驗結果

2.1.1 PEG分子量對多糖得率的影響 如圖1所示,實驗表明PEG-200/水體系作為提取溶劑時，多糖得率最高,與純水作溶劑相比提高29.09%。PEG具有的-OH基團能夠加強與多糖的相互作用,從而促進多糖在PEG/水體系中的溶解性。隨著PEG分子量的繼續增加,多糖得率表現出下降趨勢。這可能是由于低分子量的PEG-200比高分子量的PEG具有較強的極性和較低的粘度,低粘度的溶液有利于按照相似相溶的原理進行傳質[21]。這與提取金釵石斛多糖時,200 Da在不同分子量的PEG/水體系中得率最高的報道相近[22]。

圖1 PEG分子量對菠蘿蜜果皮多糖得率的影響Fig.1 Effect of molecule weight of PEG on polysaccharide yield

2.1.2 PEG-200濃度對多糖得率的影響 PEG-200的濃度決定提取溶液的極性和粘度,兩者都會影響多糖得率。由圖2可知,PEG濃度從0.1～0.3 g·mL-1時,果皮多糖得率表現出上升趨勢,當濃度為0.3 g·mL-1時，多糖得率達到最大值15.21%。這可能是由于增加濃度,有利于更多的多糖溶出;PEG改變溶液的耗散因子,有利于提高能量傳遞速度和提取效率[23]。當超過0.3 g·mL-1后,多糖得率出現下降趨勢。推測原因是溶液粘度隨著PEG濃度的增加而增大,導致粘度過高得率下降。因此,PEG-200提取菠蘿蜜果皮多糖的最佳濃度為0.3 g·mL-1。

圖2 PEG-200濃度對菠蘿蜜果皮多糖得率的影響Fig.2 Effect of concentration of PEG-200 on polysaccharide yield

2.1.3 微波功率對多糖得率的影響 微波功率是影響菠蘿蜜果皮多糖得率的重要因素之一。如圖3所示,隨著微波功率增加,多糖得率隨之增加。當功率增加到65 W時,多糖得率達到最大值。這是由于在一定范圍內增加微波功率有利于溫度上升,溫度升高提高了組織的空化率,使分離介質與顆粒的接觸面積增大[24]。微波超過65 W時,溫度過高,空化泡數量減少同時空泡破裂對樣品的影響減弱[25],多糖得率下降。因此,微波功率為65 W時較為適宜。

圖3 微波功率對菠蘿蜜果皮多糖得率的影響Fig.3 Effect ofmicrowavepoweron polysaccharide yield

2.1.4 提取時間對多糖得率的影響 多糖得率也受到提取時間的影響,這涉及到溶劑滲透到干粉狀樣品的程度，以及多糖最終從原料中轉移出的量[26]。圖4可知,提取時間為30 min時多糖得率優于其它提取時間,即在30 min時菠蘿蜜果皮粉末與PEG水溶液達到濃度平衡。超聲波和微波作用時間過長，可能會使多糖分子鏈裂解使得多糖得率下降[27]。由此,提取時間30 min較為適宜。

圖4 提取時間對菠蘿蜜果皮多糖得率的影響Fig.4 Effect ofextraction time on polysaccharide yield

2.1.5 料液比對多糖得率的影響 如圖5所示,多糖得率隨著料液比的減少而呈現上升趨勢,在料液比為1∶40 (g/mL)時多糖得率達到最大值14.67%,當料液比值小于1∶40 (g/mL)時多糖得率出現下降。原因可能是在1∶20～1∶40 (g/mL)范圍內,溶質與溶劑之間作用力變小,溶質與溶劑間濃度差增大,有利于多糖的溶出,多糖得率增加[28]。當料液比值小于1∶40 (g/mL)時,由于多糖的擴散量是一定的,后續減小料液比并不會促進多糖的擴散,且超聲波和微波對樣品的作用程度相對變小。因此選擇料液比為1∶40 (g/mL)。

圖5 料液比對菠蘿蜜果皮多糖得率的影響Fig.5 Effect ofsolid-liquid ratio on polysaccharide yield

2.2 菠蘿蜜果皮多糖超聲-微波協同提取的響應面分析

2.2.1 響應面試驗結果 由單因素實驗結果確定響應面試驗的因素及水平編碼,根據Box-Behnken試驗設計原理,在不同提取條件下研究自變量PEG-200/水體系濃度(X1)、微波功率(X2)、提取時間(X3)、料液比(X4)對菠蘿蜜果皮多糖得率(Y)的相互影響,同時優化提取工藝參數。對試驗數據進行多元回歸分析,得出提取條件與多糖得率之間的二次回歸方程:

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Scheme and result of Box-Behnken design

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of varlance for the fitted quadratic polynomial model

回歸系數線性項(X1、X2、X3、X4)的p值均小于0.001,說明均對菠蘿蜜果皮多糖得率有極顯著影響,并由F值的大小得出對多糖得率的影響從大到小依次為:X1>X2>X3>X4。在α=0.001水平上一次項和二次項均具有極顯著性。交互項X1X4差異顯著(p<0.05),其余交互項均不具有顯著性(p>0.05),表明菠蘿蜜果皮多糖得率響應值的變化十分復雜,并非簡單的線性關系,而是二次關系。

2.2.2 響應面各因素交互作用分析 由圖6可知,X1X4響應曲面坡度陡峭,兩變量等高線呈橢圓形,表明兩因素交互作用顯著。其余因素間的交互作用并不顯著。4個試驗因素中PEG-200/水體系濃度(X1)和微波功率(X2)對菠蘿蜜果皮多糖得率影響最大,隨著二者的延長,果皮多糖得率呈現上升趨勢。提取時間(X3)和料液比(X4)對多糖得率得影響較弱。

圖6 兩因素交互作用對菠蘿蜜果皮多糖得率影響的響應面分析Fig.6 Response surface plots showing the interactive effects of four extraction parameters on polysaccharide yield

2.2.3 菠蘿蜜果皮多糖提取最佳工藝條件的確定及驗證試驗 將上述多元回歸方程優化后得出Box-Behnken試驗最佳提取工藝條件為PEG-200/水體系濃度0.34 g·mL-1,微波功率68.22 W,提取時間31.69 min,料液比1∶41.23 (g/mL)。考慮到試驗中的可操作性,調整為PEG-200/水體系濃度0.34 g·mL-1,微波功率68 W,提取時間32 min,料液比1∶42 (g/mL)。

在上述優化條件下,做3次菠蘿蜜果皮多糖提取試驗,多糖得率為15.65%±0.29%,與回歸方程預測值15.89%接近且相對誤差為1.51%,表明本試驗所得多元回歸方程應用在菠蘿蜜果皮提取多糖上是準確的和可靠的。在多糖得率上比使用純水作為提取溶劑提高30.31%。相比以純水作為溶劑的傳統熱水提取法[29],該體系有效利用低分子量(Da<1000)PEG含有的羥基基團加強與多糖間的相互作用,促進目標多糖在體系中溶解,同時輔助以超聲-微波協同作用具有省時、耗能少和多糖得率高的優點。當前,低分子量PEG/水體系提取天然產物中的多糖主要使用高速逆流色譜(HSCCC,High Speed Countercurrent Chromatography)進一步純化。Zhou等[30]使用HSCCC從基于PEG-400/水體系提取的石榴皮多糖中分離出三個多糖純化組分。菠蘿蜜果皮多糖均一組分及其性質有待課題組進一步研究。

2.3 菠蘿蜜果皮多糖體外抗氧化能力比較

2.3.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基清除法已被廣泛用于評價天然化合物的抗氧化活性。分別使用純水和PEG/水體系提取所得多糖對DPPH自由基的清除能力如圖7所示,在0.25～2.0 mg/mL的濃度范圍內,JFP-P和JFP-W對DPPH自由基的清除能力分別為21.26%～69.28%和22.25%～69.72%,兩種多糖均有較強的DPPH自由基清除能力。在5個試驗濃度中JFP-P對DPPH自由基的清除率都略低于JFP-W。通過Bonferroni多重比較分析,兩種多糖清除DPPH自由基的能力在總體上不存在顯著性差異(p>0.05)。

圖7 菠蘿蜜果皮多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.7 Scavenging effect of polysaccharide from jackfruit peel on DPPH radical注:相同質量濃度不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);圖8、圖9同。

2.3.2 OH自由基清除能力 OH自由基是造成生物分子過氧化損傷的重要因素之一。在0.25～2.0 mg/mL的范圍內,兩種多糖清除OH自由基的能力隨濃度的增加而上升,呈現劑量關系。當多糖濃度在0.25～1.0 mg/mL時,JFP-P和JFP-W清除OH自由基的能力呈現上升趨勢,在之后的濃度中JFP-P和JFP-W 對OH自由基清除率增加緩慢。JFP-P對OH自由基清除率在0.25 mg/mL時略高于JFP-W,但隨著濃度的升高清除自由基的能力弱于JFP-W。通過Bonferroni多重比較分析,兩種多糖清除OH自由基的能力在總體上不存在顯著性差異(p>0.05)。通常,使用極性提取溶劑可以得到更高水平的生物聚合物多糖,在抗氧化活性方面能夠表現出更強的清除超氧陰離子、OH自由基及DPPH自由基能力和更高的還原能力[31]。試驗中JFP-P和JFP-W清除DPPH自由基和OH自由基的能力在總體上均不存在顯著性差異(p>0.05)。該結果與使用PEG-200/水體系和純水分別結合超聲波法提取金釵石斛多糖后,比較兩種多糖清除自由基的能力所得結論相近[22]。

圖8 菠蘿蜜果皮多糖對OH自由基的清除能力Fig.8 Scavenging effect of polysaccharide from jackfruit peel on hydroxyl radical

2.3.3 還原力 還原力可以作為表征天然產物抗氧化活性的指標之一,吸光度值大小可以直接指示還原能力。如圖9所示,兩種多糖在濃度范圍內,還原能力隨濃度的增加呈現上升趨勢,且表現出劑量依賴性,但都明顯低于抗壞血酸。當濃度在0.25～1.0 mg/mL時,JFP-P的還原力略高于JFP-W,當濃度超過1.0 mg/mL后,JFP-W表現出略高的還原力。通過Bonferroni多重比較分析,兩種多糖在還原力方面總體上不存在顯著性差異(p>0.05)。這與其他文獻報道的結果一致,即植物多糖對DPPH自由基和OH自由基有較強的清除活性,但是還原力相對較低[32]。

2.4 菠蘿蜜果皮多糖的紅外光譜分析

如圖10所示,JFP-P和JFP-W的紅外光譜具有一定的相似性。3600～3200 cm-1的吸收峰(JFP-P:3426.89 cm-1,JFP-W:3414.17 cm-1)是由O-H伸縮振動產生的。2930 cm-1的吸收峰(JFP-P:2930.18 cm-1,JFP-W:2930.92 cm-1)是由C-H伸縮振動產生的。上述兩個吸收峰均是多糖類物質特征吸收峰[33]。此外,1749 cm-1處的吸收峰是羰基中碳氧雙鍵非対稱伸縮振動產生,表明多糖含有羧基基團,存在糖醛酸[34]。1680～1600 cm-1相對較強的吸收峰是由于結合水的存在[35-36]。C-H的面內彎曲振動在1470～1300 cm-1之間。1200～950 cm-1的強吸收峰歸因于醚鍵(C-O-C)和吡喃糖環中存在的羥基[37]。基于低分子量PEG/水體系提取多糖的結構與生物活性間的關系仍有待深入探究。

圖10 菠蘿蜜果皮多糖的紅外光譜Fig.10 IR of polysaccharide from jackfruit peel

2.5 菠蘿蜜果皮多糖的紫外光譜分析

如圖11所示,經200～700 nm掃描后,在260 nm和280 nm處都未出現吸收峰,表明JFP-P和JFP-W均不含核酸和蛋白質。

圖11 菠蘿蜜果皮多糖的紫外光譜Fig.11 UV spectraof polysaccharide from jackfruit peel

3 結論

低分子量(Da<1000)PEG/水體系可以應用于提取菠蘿蜜果皮多糖,其優化工藝條件為PEG-200/水體系濃度0.34 g·mL-1,微波功率68 W,提取時間32 min,料液比1∶42 (g/mL),在該條件下多糖得率達15.65%±0.29%,比使用純水作為提取溶劑提高30.31%。同時多糖具有一定的清除DPPH自由基和OH自由基能力以及還原力。紅外光譜和紫外光譜表明:菠蘿蜜果皮多糖具有典型的多糖特征吸收峰且不含核酸和蛋白質。該工藝為菠蘿蜜果皮多糖進一步純化，以及探究PEG/水體系對多糖構效關系的影響奠定了基礎,同時進一步擴大了低分子量(Da<1000)PEG/水體系提取天然產物中多糖的應用范圍。