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(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319)
大麥營(yíng)養(yǎng)豐富,除蛋白質(zhì)含量較高外,還有豐富的膳食纖維、維生素及礦物質(zhì)元素。其營(yíng)養(yǎng)成分總指標(biāo)符合現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)所提出的高纖維、高維生素、高植物蛋白、低糖及低油脂的“三高兩低”新型功能食品的要求[1-2]。此外,大麥還能改善消化不良、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、減輕便秘,尤其適合中老年人食用[3]。然而,正是由于大麥富含纖維素和蛋白質(zhì),所以無(wú)論是加工制粉或是其他產(chǎn)品,都存在一定的適口性問題,這也是制約其發(fā)展的主要因素之一[4-5]。開發(fā)新型功能性大麥?zhǔn)称?不僅可以提高大麥的食品加工利用率,為大麥的綜合有效利用提供科學(xué)理論依據(jù),還可為改善國(guó)民的健康狀況做出貢獻(xiàn)。近年來(lái)谷物發(fā)酵食品的逐漸風(fēng)靡,為我們提供了一條開發(fā)功能性大麥?zhǔn)称返男峦緩健?/p>
微生物發(fā)酵不僅可以賦予谷物新的風(fēng)味和質(zhì)地,還可以改善其生理活性。Feng等[6]利用少孢根霉和酵母菌對(duì)大麥進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵并不影響氨基酸的含量和成分,也不會(huì)降低肌醇六磷酸酯的含量,但是卻能夠增加維生素B6和煙酰胺的量。Xiao等[7]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)蛹蟲草發(fā)酵后的燕麥的抗氧化能力獲得明顯提升。乳酸菌因其公認(rèn)的安全地位,其相應(yīng)的發(fā)酵食品近年來(lái)更是備受關(guān)注。然而,乳酸菌的淀粉酶和蛋白酶活力相對(duì)較低,因此乳酸菌發(fā)酵食品多以液態(tài)發(fā)酵為主,如乳酸菌大麥飲料[8]。但液態(tài)發(fā)酵存在產(chǎn)率較低、產(chǎn)品運(yùn)輸困難和投資成本高等多種問題,這嚴(yán)重阻礙了大麥的大規(guī)模利用。而固態(tài)發(fā)酵可以很好地解決這些問題。有研究表明利用微生物混合發(fā)酵法能夠有效促進(jìn)乳酸菌在固態(tài)基質(zhì)中的生長(zhǎng)[9]。Feng等[10]研究表明在少孢根霉存在下,植物乳桿菌(L.plantarumSR3.60)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentumATCC 14931)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteriDSM 20016)和乳酸乳桿菌(L.lactisSR3.53)可以在固態(tài)大麥基質(zhì)中良好生長(zhǎng)。同時(shí),在乳酸菌的作用下,大麥含有的多酚類物質(zhì)可以由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài),從而使發(fā)酵產(chǎn)物的多酚含量明顯增加,進(jìn)而增加其抗氧化活性[11]。因此,利用乳酸菌和霉菌混合固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)大麥發(fā)酵食品不僅具有理論可行性,還具有很好的開發(fā)前景。
米根霉作為傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌種,其發(fā)達(dá)的淀粉和蛋白酶體系可以為乳酸菌的生長(zhǎng)提供必需的小分子糖類和氨基酸。通過米根霉和乳酸菌混合發(fā)酵,既能賦予產(chǎn)品醇香和酸甜的風(fēng)味,又可以達(dá)到增加乳酸菌的目的,從而進(jìn)一步提升產(chǎn)品的功能特性。考慮到種皮的存在不利于微生物,尤其是乳酸菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵,本文采用大麥仁為原料,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)來(lái)確定米根霉和乳酸菌混合固態(tài)發(fā)酵大麥仁的最佳工藝,同時(shí)對(duì)產(chǎn)品的體外抗氧化活性進(jìn)行分析,從而為大麥功能性食品的開發(fā)提供新的思路和研究方向。
大麥仁 大慶市北京華聯(lián)超市;植物乳桿菌發(fā)酵劑 常州益菌加生物科技有限公司;米根霉(安琪甜酒曲) 安琪酵母股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;1,10-菲咯啉、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;H2O2、NaOH、沒食子酸、3,5-二硝基水楊酸等常規(guī)化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。
FA1104A型分析天平 上海壘固儀器有限公司;TD5A型離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司;C21-SC821型電磁爐 九陽(yáng)股份有限公司;722S型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;303A-2型電熱恒溫培養(yǎng)箱 菏澤市石油化工學(xué)校儀器設(shè)備廠。
1.2.1 大麥仁發(fā)酵工藝流程 大麥仁→清洗→浸泡→水煮→冷卻→接種→恒溫發(fā)酵→成品
操作要點(diǎn):稱取適量大麥仁,清洗后添加適量自來(lái)水室溫浸泡。沸水蒸煮至熟透,待大麥仁瀝干放涼后,分別添加0.5%(w/w)的米根霉和0.15%(w/w)的植物乳桿菌干粉發(fā)酵劑,料水質(zhì)量比為10∶1(瀝干大麥仁∶涼開水),最后置于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫發(fā)酵。
1.2.2 浸泡時(shí)間的確定 分別稱取21份20.0 g大麥仁,標(biāo)記后倒入燒杯中。每個(gè)燒杯加入100 mL蒸餾水后室溫浸泡。每隔2 h取樣測(cè)定吸水率,觀察吸水膨脹狀態(tài),確定最佳浸泡時(shí)間。
吸水率(%)=(A1-Ao)/Ao×100
式中,Ao為大麥仁初始質(zhì)量;A1為浸泡后吸干表面水分的大麥仁質(zhì)量。
1.2.3 蒸煮時(shí)間的確定 取清洗后大麥仁200 g,添加適量自來(lái)水后室溫浸泡8 h。浸泡結(jié)束后水煮,沸騰后每2 min檢驗(yàn)一次。蒸煮時(shí)間選擇以麥仁熟透且有彈性,有麥香,內(nèi)無(wú)白心為準(zhǔn)。
1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以總酸含量、還原糖含量以及感官得分為指標(biāo),研究發(fā)酵時(shí)間、接種量、接種比例與發(fā)酵溫度對(duì)大麥仁發(fā)酵品質(zhì)的影響。
1.2.4.1 發(fā)酵時(shí)間 分別稱取0.5%(w/w,發(fā)酵劑與瀝干大麥仁質(zhì)量之比)的米根霉和0.15%(w/w,發(fā)酵劑與瀝干大麥仁質(zhì)量之比)的植物乳桿菌發(fā)酵劑,采用煮沸冷卻自來(lái)水(瀝干大麥仁質(zhì)量10%)混勻后與大麥仁攪拌均勻。發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時(shí)間依次選擇24、30、36、42和48 h,發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行酸度甜度測(cè)定和感官評(píng)定,以感官評(píng)定得分為指標(biāo)確定最佳發(fā)酵時(shí)間。
1.2.4.2 接種量 在上述優(yōu)化時(shí)間基礎(chǔ)上,設(shè)定米根霉接種量(w/w)依次為0.1%、0.25%、0.5%和1%,接種比例10∶1(米根霉∶乳酸菌,w/w),發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行酸度甜度測(cè)定和感官評(píng)定,以感官評(píng)定得分為指標(biāo)確定最佳接種量。
1.2.4.3 接種比例 在上述優(yōu)化時(shí)間和接種量基礎(chǔ)上,設(shè)定接種比例(米根霉∶乳酸菌,w/w)依次為20∶1、10∶1、10∶2、10∶3和10∶4。發(fā)酵溫度30 ℃。發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行酸度甜度測(cè)定和感官評(píng)定,以感官評(píng)定得分為指標(biāo)確定最佳接種比例。
1.2.4.4 發(fā)酵溫度 在上述優(yōu)化時(shí)間、接種量和接種比例基礎(chǔ)上,設(shè)定發(fā)酵溫度依次為26、28、30、32和34 ℃。發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行酸度甜度測(cè)定和感官評(píng)定,以感官評(píng)定得分為指標(biāo)確定最佳發(fā)酵溫度。
1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以發(fā)酵時(shí)間、接種量、接種比例和發(fā)酵溫度為試驗(yàn)因素(分別以A、B、C、D 表示),以感官得分為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平見表1,每組3個(gè)重復(fù)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal test
1.2.6 總酸含量與還原糖含量的測(cè)定 總酸含量測(cè)定[12]:準(zhǔn)確稱取2 g樣品,向其中加入10 mL無(wú)二氧化碳蒸餾水。研磨樣品至勻漿后定容至25 mL。然后采用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定。總酸含量定義為1 g樣品所含酸的百分含量,以乳酸%(w/w)計(jì)。
還原糖含量測(cè)定[13]:準(zhǔn)確稱取1 g樣品,向其中加入50 mL蒸餾水搗研至勻漿。3800 r/min離心15 min,取上清液定容至250 mL作為樣品待測(cè)液。然后吸取1 mL樣品待測(cè)液,采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量。
1.2.7 感官評(píng)定 感官評(píng)定由本學(xué)院12名以上教師和學(xué)生進(jìn)行,感官評(píng)分表見表2。最終評(píng)分為所有打分平均值。

表2 感官評(píng)定表Table 2 Table of sensory evaluation score
1.2.8 總酚及體外抗氧化活性分析
1.2.8.1 總酚提取及含量測(cè)定 大麥仁多酚的提取參考付曉燕等[14]的方法略作修改。分別將發(fā)酵36 h和接種后未發(fā)酵大麥仁采用真空冷凍干燥機(jī)凍干,然后使用粉碎機(jī)粉碎后過100目篩備用。分別稱取發(fā)酵前后大麥仁凍干粉2.5 g,按料液比1∶10 (m/v)加入80%的乙醇溶液,置于50 ℃水浴中超聲(315 W)提取4 h。之后將提取液于4 ℃、10000×g條件下離心15 min,將上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收乙醇,濃縮樣品,添加去離子水定容至25 mL待測(cè)。總酚的測(cè)定采用 Folin-Ciocalteau法進(jìn)行測(cè)定[15],含量以沒食子酸當(dāng)量表示。
1.2.8.2 羥基自由基清除活性測(cè)定 采用Liu等[16]方法。取1 mL上述總酚提取液,依次加入1 mL 1,10-菲咯啉、1.5 mL 0.15 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH7.4)、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4和1 mL 0.01% H2O2,混合物于37 ℃反應(yīng)30 min后測(cè)定536 nm處的吸光值。用去離子水代替樣品作為空白對(duì)照。按以下公式計(jì)算羥基自由基清除率:
羥基自由基清除率(%)=(A1-Ao)/(A′-Ao)× 100
式中,Ao為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的吸光度值;A1為樣品實(shí)驗(yàn)的吸光度值;A′為以水代替H2O2和樣品的吸光度值。
1.2.8.3 DPPH自由基清除活性測(cè)定 采用Wang等[17]方法。取2 mL總酚提取液與2 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液(80%甲醇溶解)混勻,室溫下暗反應(yīng)30 min后測(cè)定517 nm處的吸光度值。用去離子水代替樣品作為空白對(duì)照。按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率:
DPPH自由基清除率(%)=(Ao-A1)/Ao× 100
式中,Ao為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)的吸光度值;A1為樣品反應(yīng)的吸光度值。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,p<0.05為差異顯著。
2.1.1 浸泡時(shí)間對(duì)大麥仁吸水率的影響 浸泡可使大麥仁吸水膨脹,便于后續(xù)蒸煮時(shí)淀粉充分糊化。由圖1可知,大麥仁吸水率隨浸泡時(shí)間增加而增大,0~4 h吸水率增長(zhǎng)速率較快,4~8 h吸水率增長(zhǎng)速率變緩,8 h后基本無(wú)變化(p>0.05),說明已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)。所以選擇大麥仁浸泡時(shí)間為8 h,此時(shí)吸水率為55.87%±1.19%。

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)吸水率的影響Fig.1 Effect of soak time on water absorption注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。
2.1.2 蒸煮時(shí)間對(duì)大麥仁熟度的影響 經(jīng)過多次試驗(yàn)得出,大麥仁的最佳煮制時(shí)間為沸騰后繼續(xù)水煮10 min,此時(shí)麥粒完全熟透,有彈性,有濃郁麥香,內(nèi)無(wú)白心。所以后續(xù)煮制大麥仁都以10 min為標(biāo)準(zhǔn)。
2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)還原糖含量、總酸含量及其感官得分的影響 由圖2可知,還原糖含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加先增大后減少,發(fā)酵36 h時(shí)達(dá)到最大值,為(18.49±0.25) g/100 g。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是發(fā)酵初始階段,米根霉產(chǎn)生的淀粉糖化酶將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖,還原糖含量升高,而隨著還原糖含量的升高,米根霉、乳酸菌會(huì)快速增殖,從而大量消耗還原糖,還原糖含量隨之逐漸降低;總酸含量在24 h后先減少后趨于穩(wěn)定,在48 h達(dá)到最小值0.49%±0.01%。前期研究表明,發(fā)酵開始的前18 h,總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。這是因?yàn)槿樗峋兔赘乖诎l(fā)酵初期大量分解并利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸,而18 h后總酸開始下降,這與崔春等[18]的研究結(jié)果較為一致,他們對(duì)米根霉和乳酸菌混合制曲的研究結(jié)果也表明,在發(fā)酵后期,大曲的總酸會(huì)發(fā)生下降,這可能是因?yàn)槊咕诎l(fā)酵后期消耗利用了一部分有機(jī)酸;感官得分隨發(fā)酵時(shí)間的增加先增大后減小,在接種量36 h時(shí)最高為(8.6±0.32)分。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)還原糖含量、總酸含量和感官得分的影響Fig.2 Effects of fermentation time on reducing sugar content,total acidity and sensory scores
2.2.2 接種量對(duì)還原糖含量、總酸含量及其感官得分的影響 由圖3可知,還原糖含量隨接種量的增加而增大,其接種量1%時(shí)達(dá)到最大值,為(19.73±0.1) g/100 g,可能是因?yàn)槊赘菇臃N量的增加提高了淀粉糖化酶的含量,從而導(dǎo)致還原糖含量的提高;總酸含量隨接種量的增加逐漸減小,在接種量1%時(shí)達(dá)到最小值0.36%±0.01%,造成這種結(jié)果的原因可能是米根霉數(shù)量的增加對(duì)乳酸菌造成了競(jìng)爭(zhēng)性抑制;感官得分隨接種量的增加先增大后減小,在接種量0.5%時(shí)達(dá)到最高為(8.7±0.25)分。

圖3 接種量對(duì)還原糖含量、總酸含量和感官得分的影響Fig.3 Effects of inoculation doses on reducing sugar content,total acidity and sensory scores
2.2.3 接種比例對(duì)還原糖含量,總酸含量及其感官得分的影響 由圖4可知,還原糖含量隨接種比例的減小,先增大后減少,其最大值為接種比例10∶2時(shí)為(21.35±0.18) g/100 g;總酸含量隨接種比例的減小先增加后減小,然后再增大,并在10∶3時(shí)達(dá)到最小值0.53%±0.01%,在10∶4達(dá)到最大值0.77%±0.03%;感官得分隨接種比例的減小,先增大后減小,在10∶2時(shí)最高為(8.9±0.35)分。這表明接種比例對(duì)發(fā)酵大麥仁感官影響比較大,過大或過小,都不利于良好風(fēng)味的形成。

圖4 接種比例對(duì)還原糖含量、總酸含量和感官得分的影響Fig.4 Effects of inoculation proportion on reducing sugar content,total acidity and sensory scores
2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)還原糖含量、總酸含量及其感官得分的影響 由圖5可知,還原糖含量隨發(fā)酵溫度的升高,先增加后降低最后逐漸上升,30 ℃時(shí)還原糖含量達(dá)到最高為(21.3±0.14) g/100 g。這可能是因?yàn)?6~30 ℃米根霉酶活力隨溫度的升高而增大,還原糖含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì),30~34 ℃米根霉酶活力隨溫度的升高而增小,還原糖含量有所下降;總酸含量隨發(fā)酵溫度的升高呈下降趨勢(shì),34 ℃時(shí)最低為0.45%±0.01%;感官得分隨發(fā)酵溫度的升高,先增大后減小,在32 ℃時(shí)達(dá)到最高為(9.1±0.45)分。溫度太高大麥仁色澤發(fā)暗,米根霉產(chǎn)生黑色孢子,且表層硬度大,影響口感。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)還原糖含量、總酸含量和感官得分的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on reducing sugar content,total acidity and sensory scores
正交試驗(yàn)分析結(jié)果顯示(表3),對(duì)發(fā)酵大麥仁感官評(píng)分的影響大小順序?yàn)橐蛩谻>D>A>B,最優(yōu)組合為A2B2C3D2,即發(fā)酵時(shí)間36 h,接種量0.5%,接種比例10∶3,發(fā)酵溫度32 ℃。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of L9(34)orthogonal test
該條件下獲得的發(fā)酵大麥仁呈淡黃色,表面有少量白色菌絲,有淡淡的酒香味,酸甜適口,軟硬適中(見圖6)。感官評(píng)定得分為(9.3±0.35)分,感官得分優(yōu)于未優(yōu)化工藝。因此大麥仁發(fā)酵最佳工藝參數(shù)為室溫浸泡8 h,蒸煮10 min,發(fā)酵時(shí)間36 h,接種量0.5%,接種比例10∶3,發(fā)酵溫度32 ℃。

圖6 未發(fā)酵和發(fā)酵大麥仁照片F(xiàn)ig.6 Photos of unfermented and fermented dehusked barley注:A:未發(fā)酵;B:發(fā)酵。
多酚含量分析表明,發(fā)酵0和36 h大麥仁中總酚含量分別為(0.187±0.006)和(1.290±0.041) mg/g沒食子酸當(dāng)量,這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中,微生物淀粉酶和蛋白酶等水解酶的作用,使得與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合的多酚物質(zhì)得以釋放[19]。
體外抗氧化活性分析表明(見圖7),各樣品對(duì)羥自由基和DPPH自由基均具有一定的清除能力,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。在同等濃度條件下,發(fā)酵36 h大麥仁凍干粉提取液的羥基自由基和DPPH自由基清除能力明顯增強(qiáng),發(fā)酵大麥仁(100 mg)提取液的羥基自由基和DPPH自由基清除能力,分別由發(fā)酵前的2.08%±1.29%和34.96%±0.97%增加至93.38%±0.88%和80.18%±1.58%,且抗氧化能力呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。這表明發(fā)酵對(duì)大麥仁抗氧化能力的提升有著明顯的促進(jìn)作用。研究表明大麥多酚含量較高,主要包括香草酸、香豆酸、阿魏酸、原兒茶酸和蘆丁等。這些多酚物質(zhì)以自由和結(jié)合兩種形式存在,小分子自由多酚具有較高的抗氧化性,發(fā)酵的作用主要體現(xiàn)在改變多酚物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和種類,使結(jié)合態(tài)多酚化合物變?yōu)橛坞x態(tài),從而提高其抗氧化等生物活性[11]。Hole等[20]和姚芳等[11]發(fā)現(xiàn)L.plantarum、L.johnsonii和L.reuteri等乳酸菌發(fā)酵可以顯著增加大麥中游離沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸和香豆酸的含量,而L.plantarum發(fā)酵還可導(dǎo)致大麥中香草酸和對(duì)香豆酸含量的顯著減少。這可能是因?yàn)橐恍┤樗峋梢酝ㄟ^脫羧和/或還原反應(yīng)將這些酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為其他酚化合物[19]。本研究也采用了植物乳桿菌作為發(fā)酵劑,因此,大麥仁中的酚化合物有可能發(fā)生了與上述研究相似的轉(zhuǎn)化過程。

圖7 發(fā)酵前后大麥仁提取液的羥基自由基和DPPH自由清除活性Fig.7 Scavenging rates of dehusked barley before and after fermentation on hydroxyl radical and DPPH radical
通過實(shí)驗(yàn)得出,米根霉和乳酸菌混合固態(tài)發(fā)酵大麥仁的最佳工藝條件為浸泡8 h,蒸煮10 min,發(fā)酵36 h,接種量0.5%,接種比例10∶3,發(fā)酵溫度32 ℃。該條件下得到的發(fā)酵大麥仁呈淡黃色,有淡淡的酒香味,酸甜適口,軟硬適中,感官評(píng)定得分為(9.3±0.35)分(滿分:10分)。體外抗氧化活性分析表明,發(fā)酵可以顯著提升大麥仁的抗氧化活性,發(fā)酵大麥仁(100 mg)提取液的羥基自由基和DPPH自由基清除能力,分別由發(fā)酵前的2.08%± 1.29%和34.96%±0.97%增加至發(fā)酵后的93.38%±0.88%和80.18%±1.58%。因此,利用乳酸菌和米根霉混合固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)大麥仁發(fā)酵食品,可以為大麥功能性食品的開發(fā)提供新的思路和途徑。