響應面優化酶法輔助提取山楂果膠及其體外抗氧化和抗糖化活性

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(1.遼寧大學輕型產業學院,遼寧省食品生物加工工程技術研究中心,沈陽市食品生物加工與質量控制技術重點實驗室,遼寧沈陽 110036;2.遼寧省林業科學研究院,遼寧沈陽 110036)

果膠是從高等植物細胞壁中提取的一種高分子天然多糖,主要由α-1,4糖苷鍵連接的17種不同的單糖構成[1]。作為食品添加劑,果膠被廣泛應用于糖果、冰淇淋以及焙烤食品,起到膠凝、改善質構和穩定的作用[2];作為一種天然的水溶性膳食纖維,應用于保健食品和藥品中,起到潤腸通便、清除體內重金屬等作用[3];國外在日化產品中添加少量的果膠,具有良好持水性以及抗輻射的功能[4]。此外,通過對果膠的某些特征基團進行改性,改變其膠凝性,提高生物相容性,使其更好地應用于醫療方面[5-6]。近年來,山楂果膠及其低聚糖在生理活性及作用機制的研究方面取得了重大進展。研究發現,山楂果膠具有顯著的體內外抗氧化活性[7],能夠有效清除自由基,此外還具有抗腫瘤抗炎作用[8],因此在功能食品等領域具有良好的應用前景。另有研究表明,果膠經過降解產生的寡糖,也具有改善脂代謝、抗氧化以及抗癌等生理活性[8-10]。

山楂是我國特有的藥果兼用樹種,具有重要的藥用價值[11]。我國的山楂資源豐富,主產于山東、河北、遼寧等地,經濟物廉,新鮮山楂中果膠含量高達6.4%[12]。因此,利用山楂豐富的果膠資源提高其分離提取和利用率,對于減少對果膠進口的依賴、提高經濟和社會效益具有重要的意義。酶法提取果膠是在微生物法的基礎上,通過微生物發酵提取特定的多糖降解酶,如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等降解植物細胞壁，得到果膠[13]。木聚糖酶是植物細胞壁中半纖維素主要成分木聚糖的主要降解酶,能夠有效的降解木聚糖,從而釋放水溶性的果膠成分,并且該酶對果膠沒有降解活性,因此能夠獲得更多的果膠[14]。此方法與其他方法相比,具有原料利用率高、作用條件溫和、能耗低以及綠色環保的優點[15]。

因此，本實驗采用木聚糖酶法提取山楂果膠,在對加酶量、提取溫度、pH以及提取時間進行單因素實驗的基礎上,通過響應面設計確定最優的酶法提取山楂果膠工藝參數,優化木聚糖酶提取果膠的工藝,并對提取的果膠進行體外抗氧化和抗糖化活性研究,以期為山楂的精深加工利用,提高其經濟轉化價值提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂(大金星) 產自山西,經去蒂、去核、切片、50 ℃烘箱干燥,粉碎(80目)后備用;木聚糖酶(X2753-10G,2500 U/g,綠色木霉)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、丙酮醛(methyglyoxal,MGO)、氨基胍(aminoguanidine)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazxyl,DPPH)、氯化硝基四氮唑蘭(nitroblue tetrazolium,NBT)、還原型輔酶Ⅱ(NADPH) 均為美國Sigma公司;氫氧化鈉、鄰二氮菲、半乳糖醛酸、果糖 天津市大茂化學試劑廠;無水乙醇、維生素C(VC) 沈陽市新化試劑廠;其他試劑 國產分析純。

HH.S21-6-S型電熱恒溫水浴鍋 上海龍躍儀器設備有限公司;F-4500熒光分光光度計 美國Perin公司;H/T12MM型臺式高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;PHSJ-4F實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;RE-2000A旋轉蒸發器 榮陽市科瑞儀器有限公司;SHB-III循環水式多用真空泵 鞏義市科瑞儀器有限公司;DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱 鞏義市科瑞儀器有限公司;752型紫外可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山楂果膠的提取 參照Wikiear等[14]的方法,略有修改。稱取一定量的干燥山楂粉(含水量19.8%±0.2%),按料液比1∶15 (g/mL)加入蒸餾水,取一定量木聚糖酶溶解于0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.0),按相應比例加入山楂溶液中,用1 mol/L NaOH溶液調節溶劑至一定pH、在一定溫度以及提取時間下充分攪拌(200 r/min)提取。將提取液離心(4000 r/min,10 min)回收上清液,濃縮至原體積的一半,在預實驗的基礎上,邊攪拌邊緩慢加入2倍體積的95%乙醇,靜置4 h后離心(4000 r/min,15 min)。沉淀依次用95%乙醇、無水乙醇洗脫[16],在50 ℃烘箱中干燥至恒重,所有實驗平行重復三次。

1.2.2 單因素實驗 以上述條件為基礎,考察木聚糖酶添加量(60、65、70、75、80 U/g)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)、溶劑pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、酶解時間(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)對山楂果膠得率的影響。各因素固定水平值:加酶量70 U/g、溶液pH6.0、酶解溫度50 ℃、酶解時間3.0 h。

1.2.3 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎之上,考慮到木聚糖酶自身的最適宜pH,以及pH>7時對果膠顏色的影響,選取木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時間為自變量,以果膠得率為響應值,設計三因素三水平響應面分析試驗,以果膠得率作為響應指標,優化酶法提取山楂果膠的提取工藝,具體因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析法因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 果膠得率的計算 果膠得率按公式(1)進行計算[17]:

式(1)

1.2.5 體外抗氧化能力測定

1.2.5.1 DPPH·清除活性的測定 DPPH·清除活性的測定參照Chen等[17]報道的方法進行,以VC作為陽性對照,以蒸餾水代替山楂果膠五糖作為空白對照實驗,以無水乙醇代替DPPH·溶液作為樣品干擾實驗,按式(2)計算DPPH·清除率:

式(2)

式中:A0為空白對照實驗(水代替果膠五糖溶液)的吸光度;A1為樣品實驗的吸光度。

式(3)

式中:A0為空白對照實驗(水代替果膠五糖溶液)的吸光度;A1為樣品實驗的吸光度;A2為樣品干擾實驗(0.2 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液代替NBT溶液的吸光度。

1.2.5.3 ·OH清除活性的測定 ·OH清除活性的測定參照周思思等[18]和金鳴等[19]報道的方法,以VC作為陽性對照,以PBS緩沖液代替山楂果膠五糖溶液作為空白對照實驗,以PBS緩沖液代替H2O2作為樣品干擾實驗,按式(4)計算·OH清除率:

式(4)

式中:A0為空白對照實驗(水代替果膠五糖溶液)的吸光度;A1為樣品的吸光度;A2為水代替H2O2和山楂果膠五糖溶液的吸光度。

1.2.6 抗糖化活性分析 將提取的果膠溶液分別與果糖或者MGO溶液混合,按照范智益等[20]的方法建立BSA-果糖和BSA-MGO模擬反應體系,同質量濃度的氨基胍替代果膠作為陽性對照,磷酸緩沖液替代果膠溶液作為空白對照,磷酸緩沖液替代果糖溶液(或磷酸緩沖液替代MGO)作為BSA單獨孵育組和BSA-果膠共孵育組。將混合以后的樣品置于培養箱中37 ℃孵育6 d后,在激發波長370 nm和發射波長440 nm條件下，測定樣品的熒光強度，并計算果膠對熒光性AGEs生成的抑制率。

1.3 數據處理

所有實驗均進行三次重復,結果以平均數±標準偏差表示。采用單因素Duncan法進行多重比較,以DPS v7.55軟件進行顯著性分析。顯著水平為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 木聚糖酶添加量對果膠得率的影響 由圖1可知,隨著木聚糖酶添加量的增加,果膠得率逐漸提高,當加酶量為70 U/g時,果膠得率達到峰值,隨著木聚糖酶添加量的繼續增加果膠得率略有下降。由于果膠實質是由半乳糖醛酸組成的多糖,同纖維素共同組成細胞壁,經酶的降解作用后,底物充分與酶的活性中心結合,將山楂中果膠釋放出來,當加酶量達到一定程度時,酶解程度已趨于最大化,該酶系中可能存在其他能夠水解果膠的鼠李糖苷酶,導致果膠分子鏈水解,在過濾洗滌時果膠損失,得率下降,這與宋珊珊[21]和孫玉林等[22]從不同物質中提取果膠的結果一致。因此,從實驗結果來看,木聚糖酶的最適添加量應為70 U/g。

圖1 木聚糖酶添加量對果膠得率的影響Fig.1 Effect of the amount of xylanase on the yieid of pectin

2.1.2 酶解溫度對果膠得率的影響 由圖2可知,隨著溫度的升高,果膠得率快速升高,且在50 ℃時,達到峰值,隨后溫度的增加導致果膠得率下降。由于酶作為具有生物催化功能的高分子物質,其催化特性受到溫度的影響很大,溫度升高有助于增強果膠溶出的傳質動力,增加果膠得率,但溫度高于最適宜溫度時,會使酶的活性下降或喪失,導致果膠得率下降。因此,最適酶解溫度為50 ℃。

圖2 酶解溫度對果膠得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic temperature on the yield of pectin

2.1.3 溶劑pH對果膠得率的影響 由圖3可知,隨著提取液pH的增大,果膠得率先緩慢增加然后迅速減小,且在pH為7.0時,達到峰值,當pH繼續增大到7.5時,果膠得率略有下降。由于山楂自身的酸度極高,酶解過程中溶劑的pH過低，會導致果膠的水解過度或果膠裂解等副反應的發生。此外酶本身的穩定性也受到反應環境影響,低于或高于酶的最適pH,都會影響其穩定性,進而使酶遭受不可逆破壞,使酶的活性降低。且在實驗過程中發現,pH越大,表現為提取液的顏色越深。綜合以上因素,木聚糖酶提取山楂果膠的酶解pH為7.0時，更有利于提高山楂原果膠的轉化率。

圖3 溶劑pH對果膠得率的影響Fig.3 Effect of solvent pH on the yield of pectin

2.1.4 酶解時間對果膠得率的影響 由圖4可知,酶解時間在2.5～3.0 h時,果膠得率隨酶解時間的增加迅速增加,在3.0 h處達到峰值;當酶解時間在3.0～4.0 h時,果膠得率緩慢地下降。由于木聚糖酶是一種水解酶,其參與的反應均為可逆反應,過長的反應時間導致果膠水解占主導,反而降低果膠得率。因此,酶提果膠大大縮短了反應時間,其最適酶解時間為3.0 h。

圖4 酶解時間對果膠得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the yield of pectin

2.2 響應面試驗結果

根據單因素實驗結果設計Box-benhnken試驗,運用Design-Expert 6.0軟件進行二次多元回歸擬合,得二次多元回歸方程:

Y=16.69-0.43A+0.3B-0.5C-0.25AB-0.12AC-0.19BC-1.06A2-0.57B2-1.25C2

表2 山楂果膠提取的響應面試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results of haw pectin

表3 方差分析Table 3 Analysis of varianc

根據回歸方程的一次項自變量系數可知,各單因素對果膠得率的影響大小順序為C>A>B。

由圖5～圖7可知，3D響應面圖及等高線圖可以直觀地反映木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時間兩兩交互作用與響應值果膠得率的關系,固定其中1個變量為零水平,響應值隨另兩變量的改變而變化。曲面的彎曲程度、等高線的形狀均能表示兩因素之間的相互作用的顯著程度[23]。越趨近于橢圓形表示兩因素交互作用越顯著,而圓形表示其交互作用不顯著。等高線的疏密程度表示響應值變化的快慢。等高線中的最小橢圓的中心點即是響應面的最高點。圖5～圖7的結果與方差分析一致,對于果膠的提取得率,木聚糖酶添加量、酶解溫度以及酶解時間之間的兩兩交互作用均不顯著。

圖5 木聚糖酶添加量和酶解溫度對果膠得率的等高線圖和響應面圖Fig.5 Contour polts and response surface of response of xylanase addition and enzymatic temperature on the yield of pectin

圖6 木聚糖酶添加量和酶解時間對果膠得率的等高線圖和響應面圖Fig.6 Contour polts and response surface of response of xylanase addition and enzymolysis time on the yield of pectin

圖7 酶解溫度和酶解時間對果膠得率的響應面和等高線圖Fig.7 Contour polts and response surface of response of enzymatic temperature and enzymolysis time on the yield of pectin

2.3 最佳提取工藝驗證

通過模型預測酶法提取山楂果膠的最佳工藝條件為木聚糖酶添加量為69.7 U/g,酶解溫度50.4 ℃,酶解時間2.8 h,山楂果膠得率的預測值為16.9%。

考慮到實際操作條件的局限性,最終的優化條件為木聚糖酶添加量為70 U/g,酶解溫度50.5 ℃,酶解時間3.0 h,在此條件下進行三次平行驗證,得率為16.8%±0.2%,與理論預測值較接近,說明用該模型對山楂果膠的提取進行工藝優化具有一定的實際可操作性,該結果合理可靠。本研究中酶法果膠得率為16.8%,遠遠大于本課題組之前的冷水法(10.3%)和熱水法(8.7%)[24]。

2.4 酶提法果膠的體外抗氧化能力

圖8 山楂果膠和VC對DPPH·(A)、·OH(B)和的清除作用Fig.8 Effects of remove DPPH free radicals(A),hydroxyl free radicals(B)and free radicals of haw pectic polysaccharides and VC

研究表明,果膠的生理活性與糖組成有直接關系,其體外抗氧化活性與果膠分子中半乳糖醛酸含量成正相關[25-26],但是總的體外抗氧化活性偏低,這可能與果膠分子中單糖組成有關,具體的原因需進一步研究[27-28]。

2.5 酶提法果膠的體外抗糖化能力

在非酶促條件下,蛋白質等含游離氨基的生物分子與葡萄糖和果糖等還原糖的羰基發生一系列反應,最終生成穩定的晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs),該反應叫做非酶糖基化反應[29]。AGEs在體內的長期積累能誘發多種慢性疾病,例如糖尿病,阿茲海默綜合征,老年性癡呆癥以及動脈粥樣硬化等,嚴重威脅人類的健康[29]。

酶法提取的山楂果膠分別在BSA-果糖(A)和BSA-MGO(B)模擬反應體系下的糖化抑制率如圖9所示。在BSA-果糖模擬反應體系下,當果膠濃度從20 μg/mL增加到100 μg/mL時，其糖化抑制率從20.9%增加到55.4%,相同濃度下,從60 μg/mL開始果膠的糖基化抑制率高于陽性對照氨基胍的糖化抑制率。而在BSA-MGO(B)模擬反應體系下,雖然果膠的糖化抑制率隨著濃度的增加從10.7%增加到了55.9%,但是相同濃度下其糖化抑制率始終低于陽性對照氨基胍的糖化抑制率。

圖9 山楂果膠以及陽性對照氨基胍在BSA-果糖(A)和BSA-MGO(B)模擬反應體系下的糖化抑制率Fig.9 Glycation inhibition rates of aminoguanidine and haw pectin in BSA-fructose model(A)and BSA-MGO model(B)

3 結論

綜合本實驗結果,響應面優化酶法提取山楂果膠,與傳統冷水法(10.3%)和熱水法(8.7%)得到的果膠相比,大大提高了果膠得率。本研究成果為以山楂為原料的食療保健食品的開發提供了理論基礎和科學依據,對提高我國山楂的精深加工利用效率，以及天然食源性抗氧化劑的開發，均具有巨大的經濟效益和社會效益。