藿香葉黃酮提取工藝優化及其體外抗氧化活性

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(保山學院資源環境學院,云南保山 678000)

藿香葉為唇形科藿香屬植物藿香(Agastacberugose(Fisch.et.Mey.)O.Ktze)的葉[1],藿香為多年生草本植物,又名大薄荷、土藿香、把蒿等。藿香生長適應性很強,保山當地生長旺盛,當地居民常用鮮嫩的藿香莖葉作為蔬菜食用,如:傣味藿香煮魚等。藿香的食用部位一般為嫩莖葉,其含有很多的天然植物化學成分,如黃酮類化合物[2]、礦物質和維生素[3]等,具有很高的營養保健價值。

目前,對藿香的研究主要集中在栽培技術管理[4]、精油提取[5]以及抑菌[6-8]、抗氧化[9-10]、化學成分[8,11]、藥理及營養價值[12]等幾個方面。國內外對藿香黃酮提取方面的報道較多,其提取工藝大多采用超聲波提取法[5,13],宮海燕[13]對新疆人工栽培藿香總黃酮提取法進行優選,得到超聲波提取法所得的總黃酮含量高于振蕩提取法,而利用微波輔助法提取藿香黃酮的研究鮮見報道。用微波輔助法提取植物天然有效成分的應用越來越多,微波輔助提取法就是利用微波加熱的特性，對物料中目標成分進行選擇性提取的方法。微波輔助提取方法的優點就是提取快速、高效,減少浪費,節省能源等,為植物資源的提取技術提供了一個新的研究方向[14]。

本文采用微波輔助提取法提取藿香葉的黃酮,且以黃酮得率為指標,采用L9(34)正交表進行試驗,確定最佳工藝參數,并進行驗證性試驗,同時對藿香葉黃酮的體外抗氧化性進行探討,旨在為藿香葉黃酮的深加工及藥理作用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藿香葉 采自保山市隆陽區潞江壩,經保山學院資源環境學院植物學教研室鑒定為唇形科藿香屬植物藿香,50 ℃烘干8 h,粉碎過60目篩,索氏抽提除去油脂及色素,在陰涼處陰干,備用;蘆丁標準品、DPPH、ABTS 純度99%,阿拉丁試劑公司;石油醚、亞硝酸鈉、三氯化鋁、抗壞血酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、無水乙醇等 均為分析純,國藥集團化學試劑科技有限公司。

Q/OANN 10-2008電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司;G70F20N2L-DG(SO)微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器有限公司;DFY-800搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大有限公司;UV5100紫外/可見分光光度計 安徽皖儀科技股份有限公司;N-1001旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮提取工藝 準確稱取0.5 g藿香葉樣品粉末,加一定濃度的乙醇搖勻,將微波調至一定功率(實驗用微波爐固有功率)加熱,冷卻至室溫后抽濾,取濾液定容至100 mL,避光保存為樣品液。

1.2.2 單因素實驗 對藿香黃酮得率有影響的4個因素,即料液比(A)、乙醇濃度(B)、微波功率(C)、提取時間(D)進行單因素試驗。準確稱取0.5 g藿香葉,固定因素為:25 mL 50%乙醇,微波功率406 W,提取時間50 s,分別改變料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL),乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%),微波功率(126、252、406、567、700 W),提取時間(30、40、50、60、70 s)制備樣品液,計算黃酮得率,考察各因素對黃酮得率的影響。

1.2.3 正交試驗 以料液比(A)、微波功率(B)、乙醇濃度(C)、提取時間(D)4個因素3個水平進行L9(34)正交試驗,以確定藿香葉黃酮的最佳提取條件,其試驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素和水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.2.4 標準曲線繪制 稱取蘆丁標準樣品約20.3 mg,用50%乙醇溶解并定容至50 mL,配制成濃度為0.406 mg/mL的標準樣品溶液。通過預實驗選定510 nm波長為特征吸收峰位置。分別準確吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL蘆丁標準溶液置于10 mL比色管中,分別加入2 mL水、0.3 mL 5% NaNO2溶液,搖勻,靜置5 min,在加入0.6 mL 10% AlCl3溶液,搖勻,靜置6 min,最后加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液,搖勻后用50%乙醇稀釋至刻度線,靜置10 min,在510 nm處測定吸光度。以蘆丁含量(mg/mL)為橫坐標、吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。回歸方程為y=11.254x-0.0134,決定系數R2=0.9992。蘆丁標準品在質量濃度0.0201～0.1436 mg/mL范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。

1.2.5 黃酮得率的測定 準確吸取樣品液,參照標準曲線制作方法,在510 nm波長處測定樣品吸光度A,平行測定三次,代入回歸方程,計算得到藿香葉黃酮含量。根據回歸方程,計算得到藿香葉黃酮含量,進一步計算藿香葉中黃酮得率[15]。

式中:C為線性方程計算出樣品的質量濃度(mg/mL),D為測定時定容的體積(mL),V為提取液定容體積(mL),m為稱取的樣品質量(g),B為吸取測定體積(mL)。

1.2.6 藿香葉黃酮抗氧化活性測定 在最優工藝條件下獲得藿香葉黃酮,采用二倍稀釋法配制成0.76、1.5、3.1、6.1、12.3、24.5、49.0、98.0、196.0、392.0、784.0 mg/L濃度梯度的藿香葉黃酮溶液備用。

1.2.6.1 清除·OH能力的測定 參照文獻[16-18]的方法略作修改,在比色管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL、60 mmol/L H2O2溶液1 mL和不同濃度的藿香葉黃酮溶液1 mL,搖勻,在37 ℃水浴加熱30 min,再用蒸餾水定容至10 mL,在紫外可見分光光度計510 nm波長處,分別測吸光度值A0、A1、A2,重復3次實驗。實驗設置樣品組和對照組,采用抗壞血酸作對照,抗壞血酸的濃度和藿香葉黃酮溶液濃度相同,同樣采用二倍稀釋法配制11組濃度梯度的抗壞血酸溶液。通過以下公式,即可計算出藿香葉黃酮或抗壞血酸對·OH的清除率,并根據SPSS 19.0軟件計算出IC50值(即自由基清除率達到50%時樣品的濃度)。

式中:A1為加入藿香葉黃酮樣品所測吸光度,A2為用同體積蒸餾水代替過氧化氫溶液所測吸光度,A0為用同體積蒸餾水代替藿香葉黃酮樣品液的空白對照組的吸光度。

1.2.6.2 DPPH·清除能力的測定 參照文獻[17,19]的方法略作修改,在比色管中依次加入0.5 mmol/L DPPH·乙醇溶液2 mL、無水乙醇2 mL和不同濃度的藿香葉黃酮溶液2 mL,混勻,避光室溫放置30 min后,定容至10 mL,在517 nm處分別測吸光度A0、A1、A2,重復3次實驗,對照組采用抗壞血酸作對照,抗壞血酸的濃度和藿香葉黃酮溶液濃度相同。通過以下公式即可計算出藿香葉黃酮或抗壞血酸對DPPH·的清除率,并計算出IC50值。

式中:A1為加入藿香葉黃酮樣品所測吸光度,A2為用同體積無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液所測吸光度,A0為用同體積蒸餾水代替藿香葉黃酮樣品液的空白對照組的吸光度。

1.2.6.3 ABTS+·清除能力的測定 依照文獻[20-22]的方法進行,ABTS+·儲備液:7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液等量混合,室溫下避光反應16～18 h。ABTS+·工作液:吸取1 mL儲備液以無水乙醇稀釋,使吸光值在734 nm處達0.7±0.02,ABTS+·工作液現配現用。取1.5 mL的ABTS+·工作液與0.5 mL的藿香葉黃酮溶液混合,在室溫下避光靜置10 min后,于734 nm處測定吸光值。對照組采用抗壞血酸作對照,抗壞血酸的濃度和藿香葉黃酮溶液濃度相同。通過以下公式即可計算出藿香葉黃酮或抗壞血酸對ABTS+·的清除率,并計算出IC50值。

式中:A1為加入藿香葉黃酮樣品所測吸光度,A2為用同體積蒸餾水代替ABTS+·工作液所測吸光度,A0為用同體積蒸餾水代替藿香葉黃酮樣品液的空白對照組的吸光度。

1.3 數據處理

所有實驗數據均為三次重復實驗結果的平均值,數據用均數±標準差表示。應用Excel軟件對實驗數據進行曲線擬合,得回歸方程,計算IC50值,運用SPSS 19.0 進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 藿香葉黃酮提取的單因素實驗結果

2.1.1 料液比對藿香葉黃酮得率的影響 如圖1所示,當料液比在1∶20～1∶50 g/mL時,藿香葉黃酮得率隨料液比升高而升高,當料液比達到1∶50 g/mL時,黃酮得率達到最大。料液比超過1∶50 g/mL,黃酮得率隨著料液比的增大而減小,這是由于液料比過大,溶劑揮發帶來的損失會增大,從而導致黃酮得率有所下降[15]。因此,藿香葉黃酮提取的最佳料液比為1∶50 g/mL。

圖1 料液比對藿香葉黃酮得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of flavonoids from the leaf of Agastacbe rugose注:不同小寫字母表示差異顯著,p<0.05;圖1～圖4同。

2.1.2 乙醇濃度對藿香葉黃酮得率的影響 結果如圖2所示,當乙醇濃度在30%～60%時,藿香葉黃酮得率隨著乙醇濃度的增大而增大,當乙醇濃度為60%時,藿香葉黃酮得率達到最大為5.90%,當乙醇濃度超過60%后,黃酮得率隨乙醇濃度增大而減小。這是由于乙醇濃度過大,會使一些醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分溶出量增加,這些成分與黃酮類化合物競爭乙醇,從而導致溶出的黃酮類化合物減少[15]。提取藿香葉黃酮時,最佳乙醇濃度為60%。

圖2 乙醇濃度對藿香葉黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of flavonoids from the leaf of Agastacbe rugose

2.1.3 微波功率對藿香葉黃酮得率的影響 由圖3可知,當微波功率在126～406 W時,藿香葉黃酮得率隨微波功率的增大而增大,微波功率為406 W時,黃酮得率達到最大值(5.95%),這是由于功率增大,加熱速率也增大,分子運動、物質滲透、擴散和溶解速度加快,有利于黃酮類物質溶出。當微波功率超過406 W時,黃酮得率隨微波功率增大而降低,這可能是因為功率較大時,溫度過高,對黃酮物質產生破壞,溶解出雜質也增多,導致得率下降[23]。因此,藿香葉黃酮提取的最佳微波功率為406 W。

圖3 微波功率對藿香葉黃酮得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on extraction yield of flavonoids from the leaf of Agastacbe rugose

2.1.4 提取時間對藿香葉黃酮得率的影響 結果見圖4,提取時間在30～60 s時,藿香葉黃酮得率隨提取時間的延長而升高,當提取時間達到60 s時,黃酮得率達到最大為5.98%。但超過60 s后,黃酮得率隨時間的延長而呈下降趨勢。藿香葉黃酮得率隨著提取時間的增長而呈先增加后下降的變化規律,一方面可能是因為黃酮在高溫條件下易發生氧化,提取時間太長,黃酮得率反而下降[15];另一方面,可能是加熱時間過短時,溫度較低,不利于黃酮的提取,而時間過長時產生過高溫度,導致黃酮物質分解,而且時間過長,溶劑也可能大量揮發,還會發生暴沸[23]。因此,藿香葉黃酮得率的最佳提取時間為60 s。

圖4 提取時間對藿香葉黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave time on extraction yield offlavonoids from the leaf of Agastacbe rugose

2.1.5 藿香葉黃酮提取正交試驗結果 正交試驗結果見表2，綜合R值大小來評價影響保山藿香葉黃酮得率的因素順序為A>C>B>D,即料液比>微波功率>乙醇濃度>提取時間。從藿香葉黃酮得率的結果看,最佳工藝為8號實驗A3B2C1D3,其黃酮得率為6.01%;但從k值直觀分析可知,藿香葉黃酮提取的最優工藝方案為:A3B2C3D3。對A3B2C3D3和A3B2C1D3分別進行3次平行重復實驗,藿香葉黃酮的平均得率分別為6.11%和6.03%。結果表明,藿香葉的黃酮提取的最佳工藝參數組合為A3B2C3D3,即料液比1∶60 g/mL、乙醇濃度60%、微波功率567 W、提取時間70 s。在此條件下黃酮得率達最大值,結果表明所選工藝合理、可行,可用于藿香葉黃酮提取工藝。

表2 正交實驗及結果分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

2.2 藿香葉黃酮對·OH清除能力的影響

由圖5可知,藿香葉黃酮和抗壞血酸對·OH的清除率隨濃度的增大而增大,當濃度達到784.0 mg/L時,其清除率分別為92.0%和50.8%,差異明顯。藿香葉黃酮和抗壞血酸對·OH清除率的IC50值為:藿香葉黃酮IC50=281.89 mg/L,抗壞血酸的IC50=725.69 mg/L。藿香葉黃酮的IC50值較抗壞血酸的IC50值小很多,說明藿香葉黃酮抗氧化效果優于抗壞血酸,且根據·OH清除曲線可以看出,藿香葉黃酮在較高濃度時具有很強的·OH清除能力。

圖5 藿香葉黃酮對·OH清除能力的影響Fig.5 Effects of OH radical scavenging capacity of flavonoids from the leaf of Agastacbe rugose

2.3 藿香葉黃酮對DPPH·清除能力的影響

由圖6可知,藿香葉黃酮和抗壞血酸對DPPH·的清除率隨其濃度的增大而增大,當藿香葉黃酮濃度達到49 mg/L時,DPPH·的清除率增加緩慢,最后趨于平緩直線。從藿香葉黃酮和抗壞血酸對DPPH·清除率的IC50值結果來看,其強弱順序為:藿香葉黃酮(IC50=3.57 mg/L)>抗壞血酸(IC50=15.36 mg/L)。在濃度0.76～24.5 mg/L范圍內,藿香葉黃酮對DPPH·的清除率優于抗壞血酸,說明藿香葉黃酮抗氧化活性優于抗壞血酸,在濃度24.5～784 mg/L范圍內,抗壞血酸對DPPH·的清除率優于藿香葉黃酮。綜合來看,藿香葉黃酮具有良好的DPPH·清除能力。

圖6 藿香葉黃酮對DPPH·清除能力的影響Fig.6 Effects of DPPH radical scavenging capacity of flavonoids from the leaf of Agastacbe rugose

2.4 藿香葉黃酮對ABTS+·清除能力的影響

由圖7可知,在濃度0.76～6.1 mg/L之間,藿香葉黃酮和抗壞血酸對ABTS+·的清除率隨其濃度的增大而增大,當濃度達到6.1 mg/L時,藿香葉黃酮對ABTS+·的清除率就達到96.5%,是同濃度抗壞血酸對ABTS+·清除率的2.6倍。從藿香葉黃酮和抗壞血酸對ABTS+·清除率的IC50值結果來看,其強弱順序為:藿香葉黃酮(IC50=1.52 mg/L)>抗壞血酸(IC50=6.48 mg/L),說明藿香葉黃酮抗氧化活性優于抗壞血酸,具有很好的ABTS+·清除能力。

圖7 藿香葉黃酮對ABTS+·清除能力的影響Fig.7 Effects of ABTS+ radical scavenging capacity of flavonoids from the leaf of Agastacbe rugose

總的來說,本研究結果與其他學者[17,24]在這方面的研究結果相似。藿香葉黃酮清除·OH、DPPH·、ABTS+·活性的能力良好,尤其對ABTS+·清除能力最優。這一結果與付曉丹等[24]對枇杷葉黃酮抗氧化活性研究結果一致:植物莖葉黃酮表現出較好的清除DPPH·、ABTS+·的能力,在實驗濃度范圍內,隨著黃酮濃度的增加,其清除自由基的活性增大。

3 結論

本研究采用微波輔助乙醇浸提保山藿香葉黃酮,分別考察各單因素對黃酮提取得率的影響,并通過單因素實驗和L9(34)正交設計對提取工藝進行優化,得到各因素對黃酮提取得率影響程度大小為:料液比>微波功率>乙醇濃度>提取時間,通過優化得到藿香葉黃酮提取的最佳條件為料液比1∶60 g/mL、乙醇濃度60%、微波功率567 W、微波時間70 s,此條件下藿香葉黃酮提取得率為6.11%。此條件下制得的藿香葉黃酮通過體外抗氧化實驗得出:藿香葉黃酮對·OH、DPPH·、ABTS+·具有較好的清除效果,其IC50分別為281.89、3.57、1.52 mg/L,藿香葉黃酮清除·OH、DPPH·、ABTS+·活性的能力良好,尤其對ABTS+·清除能力最優,表明藿香葉黃酮具有較強的體外抗氧化活性。該研究為系統開發藿香葉黃酮成分的應用提供基礎,對保山藿香的開發利用具有較大指導意義。