枯草芽孢桿菌M364高產抗菌肽Bacillomycin D工業培養基優化

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(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是在自然界中廣泛存在的一類嗜溫、好氧且產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌,已被美國食品藥品監督管理局(FDA)界定為“GRAS”(generally recognized as safe)[1-2]。枯草芽孢桿菌合成、分泌的抗菌物質是具有表面活性的一類抗菌脂肽(antimicrobial peptides,AMPs),如Surfactin家族、Iturin家族和Fengycin家族[3-6]。抗菌肽Bacillomycin D是由枯草芽孢桿菌非核糖體酶催化合成的一種屬于Iturin家族的抗菌脂肽,它是由一個親水性環狀七肽和一個疏水性β-氨基脂肪鏈相連而成的，具有表面活性的雙親性環狀脂肽[7]。Bacillomycin D的理化性質穩定,121 ℃、30 min保持95%抗菌活性,pH7.6活性最強,且對蛋白酶類不敏感;25 W紫外燈下,距離約5 cm,照射8 h不影響活性,這與Iturins家族的理化特性一致[8-9]。Bacillomycin D是抑制黃曲霉最強的一種脂肽抗生素,并具有與其它脂肽類抗生素無交叉耐藥性、安全無毒、抗菌譜廣、易被生物降解等優點[10-11],因此Bacillomycin D在食品或糧食防腐方面具有廣闊的應用前景。

長期以來,抗菌肽的發酵水平和生產效率偏低以及較高的生產成本，制約著其開發利用和工業化生產。目前Bacillomycin D的發酵生產培養基以葡萄糖[12]、酵母膏[12-13]和谷氨酸鈉[14]為主要碳、氮源,發酵過程中需要補料和控制pH,過程復雜且能耗高,這并不適用于大規模工業生產。一些研究利用菊糖[15]或L-谷氨酰胺[16]通過代謝調控可提高Bacillomycin D產量,或者通過傳統誘變[13]或基因組改組[17]篩選高產Bacillomycin D菌株均是使用現有的培養基,沒有對培養基成本進行考慮,成本較高。我國是農業大國,而玉米漿是在玉米淀粉的制作過程中的副產物,其制作原料易得并且價格低廉,如果能以玉米淀粉加工副產物代替葡萄糖或谷氨酸鈉,不但可以提高副產品的利用率,還能在提高Bacillomycin D產量的同時降低其生產成本。因此,通過培養基及發酵工藝優化,尋找能夠降低生產成本、提高抗菌肽產量的方法具有重要的研究意義。

本研究主要是對誘變菌M364發酵產抗菌肽Bacillomycin D的培養基進行優化。以一種Bacillomycin D產量略高于常用的Landy(240 mg/L)配方的廉價培養基6010為基礎培養基,在單因素實驗基礎上,先后利用Plackett-Burman實驗、Central Composite Design響應面設計對枯草芽孢桿菌M364發酵生產Bacillomycin D的培養基6010進行優化,并通過19 L發酵罐進行驗證,旨在提高抗菌肽Bacillomycin D的產量為后續擴大培養奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌M364 由枯草芽孢桿菌BacillussubtilisfmbJ(CGMCC NO.0943)通過亞硝酸胍誘變得到的突變菌株;乙腈、三氟乙酸、甲醇 色譜純,Tedia公司;其它試劑 分析純,國藥集團;斜面培養基NB(g/L) 牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂20,pH7.0～7.2；種子培養基 不添加瓊脂,其余組分同斜面培養基NB；初始發酵培養基Landy(g/L) 酵母膏1.0,谷氨酸鈉5,KCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,L-苯丙氨酸0.02,CuSO4·5H2O 0.0016,FeSO40.0015,KH2PO41.0,葡萄糖20,pH7.0;6010培養基(g/L) 麥芽糖漿50,葡萄糖20,玉米漿20,尿素3,(NH4)2SO46,K2HPO46,MgSO4·7H2O 0.1,MnSO4·H2O 0.03,pH7.0。

TOMY SX-700高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY公司;L1523 19L-原位滅菌發酵罐 瑞士比歐生物工程公司;全溫搖瓶柜 江蘇太倉實驗設備廠;Ultimate3000高效液相分析系統 美國賽默飛公司;高速離心機 德國Eppendorf公司;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Bacillomycin D的發酵生產 將B.subtilisM364在斜面培養基上進行劃線,于37 ℃培養箱進行過夜活化16 h,挑取單菌落,接入種子培養基,于37 ℃,180 r/min培養12 h。將種子液按體積分數5%接種至50 mL發酵培養基,培養72 h。搖瓶發酵均在250 mL三角瓶進行,發酵溫度為33 ℃,轉速為180 r/min。

1.2.2 Bacillomycin D的提取 取發酵液,8000 r/min常溫離心10 min,得上清液。用2 moL/L HCl將上清液pH調至2.0,4 ℃靜置12 h,4 ℃條件下8000 r/min離心10 min,棄上清得沉淀,向沉淀中加入純甲醇進行萃取,用4 moL/L NaOH將萃取液pH調至7.0,4 ℃條件下8000 r/min離心10 min,棄沉淀得上清,即為Bacillomycin D粗品。

1.2.3 單因素實驗設計 以原始6010培養基為基礎培養基,進行單因素實驗。發酵條件如1.2.1所述,發酵結束后HPLC法測Bacillomycin D產量,考察不同成分添加量的范圍,每組實驗重復3次。其中,麥芽糖漿添加量為30.0、40.0、50.0、60.0、70.0 g/L;葡萄糖添加量為0、10.0、20.0、30.0、40.0 g/L;玉米漿添加量為10.0、20.0、30.0、40.0 mL/L;尿素添加量為0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L;(NH4)2SO4添加量為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L;K2HPO4添加量為4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 g/L;MgSO4·7H2O添加量為0.05、0.10、0.30、0.50、0.70 g/L;MnSO4·H2O添加量為0.01、0.03、0.06、0.09、0.12 g/L。當變化其中一個因素的添加水平時,其余7個因素固定為基礎培養基6010原始添加水平。

1.2.4 Plackett-Burman實驗 利用Design-Expert 8.0.6中的實驗設計功能,使用Plackett-Burman法設計實驗,可以用相對較少的實驗次數判斷出較多因素對Bacillomycin D產量影響的重要性,并初步估計合適的添加量。根據單因素實驗結果,選用n=11的Plackett-Burman設計對發酵培養基6010的7個組分:麥芽糖漿、玉米漿、尿素、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O的重要性進行考察,篩選出對Bacillomycin D產量影響顯著的關鍵因素,具體因素水平如表1。

表1 Plackett-Burman設計因素水平表Table 1 Factors and levels for the Plackett-Burman design

1.2.5 中心組合設計(Central Composite Design) 響應面優化法與傳統的正交優化法相比,更適合多變量復雜體系的優化分析,而且可充分考慮因素間交互作用對響應變量的影響[18]。中心組合設計是通過構建經驗數值模型并經回歸分析和方差分析,可用于尋找最優參數組合和評價復雜體系中各因素的影響重要性,適用于微生物次級代謝產物的培養基優化[19]。由于PB試驗結果顯示尿素對Bacillomycin D產量是負影響,且影響較大,所以為縮小尿素范圍,選擇0.76 g/L為尿素響應面優化時的中心點。結合1.2.4 Plackett-Burman實驗結果與中心組合設計原理,設計3因素5水平共20個試驗點的試驗方案,其中14個點是析因點,剩余6個點為中心復合點,各試驗因素水平如表2。

表2 中心組合設計因素水平表Table 2 The factors and levels for the Central Composite Design

1.2.6 優化后培養基-19 L發酵罐驗證 發酵培養基采用1.2.5優化后培養基,裝液系數0.52,將種子液按體積分數10%接種至19 L發酵罐,通氣量為1.5 vvm,轉速為500 r/min,pH自然。0～4 h培養基培養溫度為35 ℃,4～7 h逐漸降至33 ℃,培養48 h。發酵液溶氧量(DO%)和pH分別由發酵罐自帶的溶氧電極和pH電極直接測得。前期每2 h取1次樣,在波長600 nm下檢測發酵液OD值,并用HPLC檢測Bacillomycin D產量,以確定Bacillomycin D產量最高點及最佳放罐時間。

1.2.7 Bacillomycin D含量檢測 采用RP-C18柱進行高效液相色譜分析Bacillomycin D產量[7]。以A:乙腈+0.1%三氟乙酸,B:水+0.1%三氟乙酸,為流動相進行梯度洗脫。0～15 min內,A相由30%線性增加為45%,B相由70%線性減少到55%;15～35 min,A相由45%增加為55%,B相由55%減少到45%。進樣量:20 μL;柱溫:25 ℃;檢測波長:225 nm;流速:0.6 mL/min;Bacillomycin D的標準曲線為:y=7.6396x-2.3576,x:峰面積;y:Bacillomycin D濃度(mg/L),R2=0.9999。

1.3 數據處理

實驗數據處理采用Excel 2010軟件,對實驗所得數據進行平均值和標準差計算,以及作圖。響應曲面試驗設計及統計分析使用Design-Expert.v 8.0.6軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 麥芽糖漿添加量對Bacillomycin D產量的影響 如圖1所示,隨著麥芽糖漿添加量的增加,Bacillomycin D產量增加,當添加量為50 g/L時,產量最高;當麥芽糖漿添加量大于50 g/L時,Bacillomycin D的產量呈下降趨勢。這是因為麥芽糖漿是6010培養基中的主要碳源,它可被麥芽糖酶水解成2個葡萄糖分子,能夠有效地為菌體生長、代謝提供所需的能量。但麥芽糖漿添加量過高時,分解代謝形成的葡萄糖含量過高，不僅造成培養基碳氮比失衡，而且糖含量太高也會使得發酵過程中培養基pH過低，影響菌體的活性,進而影響次級代謝產物的合成。因此,初步確定麥芽糖漿添加量為50.0 g/L效果最好。

圖1 麥芽糖漿添加量對Bacillomycin D產量的影響Fig.1 Effect of maltose syrup addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.2 葡萄糖添加量對Bacillomycin D產量的影響 如圖2所示,Bacillomycin D產量隨著葡萄糖添加量的增加呈下降趨勢,且不添加葡萄糖時產量最高。這是因為Bacillomycin D是枯草芽孢桿菌生長到穩定后期產生的次級代謝產物,葡萄糖屬于速效碳源,主要在菌體生長初期被利用,而麥芽糖漿水解成葡萄糖分子為菌體后期代謝提供足夠的能量。所以額外添加葡萄糖造成培養基pH過低,以及葡萄糖阻遏效應的發生，影響菌體生長、代謝,這與闞欣等[20]和李紅等[21]研究結果一致,因此剔除葡萄糖。

圖2 葡萄糖添加量對Bacillomycin D產量的影響Fig.2 Effect of glucose addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.3 玉米漿添加量對Bacillomycin D產量的影響 如圖3所示,隨著玉米漿添加量增加,Bacillomycin D產量增加,當其添加量為20 mL/L時產量最高;當玉米漿添加量大于20 mL/L時,Bacillomycin D產量呈下降趨勢。因為玉米漿含有豐富的氨基酸、核酸和一些前體物質等,其中生物素作為菌體細胞膜合成的必要元素,能夠調節細胞膜的通透性,同時也是羧化酶系等關鍵酶的輔酶,對細胞中心代謝具有重要的調控作用[22],所以有機氮源玉米漿是提供細胞生長的的主要物質。在玉米漿添加量較低時,菌體生長很微弱,Bacillomycin D產量較低,但含量過高時,會造成培養基碳氮比失衡，同樣不利于細胞的生長代謝[23]。因此,初步確定玉米漿添加量為20.0 mL/L時效果最好。

圖3 玉米漿添加量對Bacillomycin D產量的影響Fig.3 Effect of corn steep liquor addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.4 尿素添加量對Bacillomycin D產量的影響 如圖4所示,Bacillomycin D產量隨著尿素添加量的增加,呈快速增加趨勢,當添加量大于1.0 g/L時,Bacillomycin D產量逐漸下降。由于6010培養基中含有多種氮源,不添加尿素時Bacillomycin D產量依然達到420 mg/L,但達不到尿素和其它氮源混合使用時的效果;當尿素添加量過高時,導致培養基碳氮比降低,發酵培養基pH過高,菌體活性受到抑制且不利于產物的積累。因此,初步確定尿素添加量為1.0 g/L時效果最好。

圖4 尿素添加量對Bacillomycin D產量的影響Fig.4 Effect of urea addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.5 (NH4)2SO4添加量對Bacillomycin D產量的影響 如圖5所示,隨著(NH4)2SO4添加量增加,Bacillomycin D產量呈升高后降低趨勢,當(NH4)2SO4添加量為4.0 g/L時Bacillomycin D產量最高,但(NH4)2SO4添加量的變化對Bacillomycin D產量影響并不明顯。在菌體生長初期,玉米漿中的多肽、蛋白類物質沒有降解,無法提供有機氮源時,(NH4)2SO4作為速效氮源,其銨根離子可以為菌體提供無機氮源,以便菌體的快速增殖,此外(NH4)2SO4的加入有助于降低尿素對培養基pH帶來的影響。但過量的(NH4)2SO4會降低培養基碳氮比,不利于菌體的生長代謝。因此,初步確定(NH4)2SO4添加量為4.0 g/L時效果最好。

圖5 (NH4)2SO4添加量對Bacillomycin D產量的影響Fig.5 Effect of(NH4)2SO4 addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.6 K2HPO4添加量對Bacillomycin D產量的影響 如圖6所示,Bacillomycin D產量隨著K2HPO4添加量的增加呈遞增趨勢,當添加量為8.0 g/L時產量最高,之后再增加K2HPO4添加量，Bacillomycin D產量逐漸降低。磷酸鹽在微生物發酵過程中不僅可以維持培養基pH穩定,而且是菌體核酸合成代謝所必需的元素[24],同時氨基酸前體的活化及一些與代謝有關的酶的合成都與磷酸根有關,其添加量的高與低都會抑制抗菌肽產量[25]。因此,初步確定K2HPO4添加量為8.00 g/L時效果最好。

圖6 K2HPO4添加量對Bacillomycin D產量的影響Fig.6 Effect of K2HPO4 addition on the yield of Bacillomycin D

2.1.7 MgSO4·7H2O添加量對Bacillomycin D產量的影響 如圖7所示,MgSO4·7H2O添加量在0.05～0.30 g/L時,Bacillomycin D產量隨著Mg2+添加量的增加而增加;當Mg2+添加量達到0.30 g/L時,Bacillomycin D產量最高,此時再增加Mg2+添加量,Bacillomycin D產量呈下降趨勢。這是因為Mg2+是許多重要酶的激活劑,一般認為Mg2+與磷酸功能團生成鰲合結構,形成一種在轉移反應中達到最大活性的構型。而能量轉移的基本過程發生于糖酵解、三羧酸循環和呼吸過程(如己糖磷酸化酶、異檸檬酸脫氫酶、羧化酶等)中,所以Mg2+在糖酵解和三羧酸循環等幾乎所有磷酸化過程的酶促反應中起輔助因素作用,因此合適的Mg2+添加量促進Bacillomycin D的產生,然而添加過量的Mg2+會對細胞產生毒害作用[26-27]。因此,初步確定MgSO4·7H2O添加量為0.30 g/L時效果最好。

圖7 MgSO4·7H2O添加量對Bacillomycin D產量的影響Fig.7 Effect of MgSO4·7H2O addition on the yield of Bacillomycin D

注:*:差異顯著(p<0.05),**:差異極顯著(p<0.01),表6同。2.1.8 MnSO4·H2O添加量對Bacillomycin D產量的影響 如圖8所示,Bacillomycin D產量隨著MnSO4·H2O添加量的增加而增加,當MnSO4·H2O添加量為0.06 g/L時抗菌肽產量最高,MnSO4·H2O添加量再增加,Bacillomycin D產量逐漸降低。Mn2+是菌體生長和產酶所需要的離子,其存在可加速菌體的生長及產酶量進而促進Bacillomycin D產量的增加,但Mn2+過高時會對細胞產生毒害作用,影響菌體活性。因此,初步確定MnSO4·H2O添加量為0.06 g/L時效果最好。

圖8 MnSO4·H2O添加量對Bacillomycin D產量的影響Fig.8 Effect of MnSO4·H2O addition on the yield of Bacillomycin D

2.2 Plackett-Burman Design(PB)試驗結果

PB實驗是通過對每個因子取兩水平來分析,通過比較各個因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性,實驗設計與結果如表3所示。

根據表3的試驗結果,進行方差分析,結果如表4所示,該模型具有較高顯著性(p模型=0.0041<0.01),擬合度較好(R2=97.67%)。盡管PB實驗顯示因素D對Bacillomycin D產量影響極顯著(p<0.01),但單因素實驗證實(NH4)2SO4添加量變化對Bacillomycin D產量無明顯影響,因此，根據PB實驗中各因素對Bacillomycin D產量影響力的大小及顯著性,選取尿素(p=0.0011)、麥芽糖漿(p=0.0053)、MgSO4·7H2O(p=0.0047)進一步優化。其他因子正效應取(+1)水平,負效應取(-1)水平。

表4 PB試驗各因素對Bacillomycin D產量影響的方差分析Table 4 Analysis of variance for influence of variable on Bacillomycin D yield in the Plackett-Burman design

2.3 CCD試驗結果

2.3.1 模型建立及顯著性檢驗 通過對PB實驗結果的分析,以Bacillomycin D產量(Y)為響應值,麥芽糖漿(X1)、尿素(X2)、MgSO4·7H2O(X3)添加量為變量,其它培養基組分維持恒定進行響應面設計,響應面設計與結果如表5所示。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結果進行二次回歸模擬,得到模型的二次回歸方程:

表6 中心組合設計的方差分析Table 6 ANOVA of the central composite design

2.3.2 響應面優化及分析 響應曲面是在所考察的三個因素中的任意兩個因素水平固定的前提下,以中心組合設計中的響應值為縱坐標,其他因素分別為水平面上的兩垂直橫坐標所構成的三維模型[28]。

從圖9可以看出,等高線為橢圓形,表明MgSO4·7H2O添加量一定時,麥芽糖漿和尿素之間存在交互作用。當尿素添加量保持不變,麥芽糖漿添加量低于46.0 g/L時,隨著麥芽糖漿添加量增加,Bacillomycin D產量增加。當麥芽糖漿添加量高于46.00 g/L時,隨著麥芽糖漿添加量增加,Bacillomycin D產量減少,并且在不同的尿素添加量下,變化幅度存在差別。麥芽糖漿增加到一定添加量時,培養基中的氧的供給就會受到限制,而且過高的含糖量會造成細胞的無氧呼吸,發酵液pH過低都會影響到菌體的活性。保持麥芽糖漿添加量不變時,隨著尿素添加量的增加,抗菌肽Bacillomycin D產量增加,當尿素添加量超過0.72 g/L時,Bacillomycin D產量逐漸降低。由于培養基中含有多種氮源,適當的尿素添加量可以提高抗菌肽產量,過多的尿素會造成碳氮比失衡,導致Bacillomycin D產量下降。

圖9 麥芽糖漿與尿素對Bacillomycin D產量的影響Fig.9 Effect of maltose syrup and urea on the Bacillomycin D production

圖10顯示等高線為橢圓形,這表明尿素添加量一定時,麥芽糖漿和MgSO4·7H2O之間存在交互作用。無論MgSO4·7H2O處于何種水平,隨著麥芽糖漿添加量的增加,抗菌肽Bacillomycin D產量呈先增加后降低的趨勢,過量的麥芽糖漿會造成培養基碳氮比失衡,培養基pH過低,抑制細胞的生長,降低細胞中酶的活性。當麥芽糖漿處于低水平時,隨著MgSO4·7H2O添加量的變化,雖然Bacillomycin D產量也是呈先增加后降低的趨勢,但變化幅度并不明顯,原因可能是此時Mg2+對酶的影響不是主要限制因素,麥芽糖漿所能提供的能量是限制Bacillomycin D產量的主要影響因素。這也與方差分析顯示的麥芽糖漿對Bacillomycin D產量影響程度要大于MgSO4·7H2O帶來的影響所吻合。

圖10 麥芽糖漿與MgSO4·7H2O對Bacillomycin D產量的影響Fig.10 Effects of maltose syrup and MgSO4·7H2O on the Bacillomycin D production

圖11顯示等高線為橢圓形,表明麥芽糖漿添加量一定時,尿素和MgSO4·7H2O之間存在交互作用且交互作用顯著(p<0.05)。無論MgSO4·7H2O處于什么水平,隨著尿素添加量的增加,抗菌肽Bacillomycin D產量先升高后降低。尿素添加量過低時，不足以提供發酵過程中所需氮源,且與其它種類氮源無法起到復配效果[29],而尿素添加量過高時，又造成培養基碳氮比失衡和培養基pH過高，同樣影響Bacillomycin D產量。無論尿素添加量處于什么水平時,隨著MgSO4·7H2O添加量的增加,抗菌肽Bacillomycin D產量先升高后降低。Mg2+不僅是許多重要酶的激活劑,而且有研究表明,Mg2+也可能是作用于某些生物合成途徑,調節與抗生素生物合成相關基因的轉錄來影響次級代謝[30]。因此Mg2+與麥芽糖漿、尿素都有一定的交互作用,且與尿素的交互作用顯著(p<0.05)。

圖11 尿素與MgSO4·7H2O對Bacillomycin D產量的影響Fig.11 Effects of urea and MgSO4·7H2O on the Bacillomycin D production

2.4 最佳培養基的確定及驗證

根據模型得到的最佳工業培養基為:麥芽糖漿46 g/L,尿素0.72 g/L,MgSO4·7H2O 0.35 g/L,玉米漿16 g/L,(NH4)2SO43 g/L,K2HPO47 g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L,在此條件下預測的最大產量為596.89 mg/L。以此培養基進行33 ℃,180 r/min發酵72 h,最終Bacillomycin D產量達到(620.2±13.9) mg/L,與預測值較為接近,說明優化模型穩定可靠。

2.5 19 L發酵罐放大試驗結果

搖瓶研究初始培養溫度和接種量分別為33 ℃和5%,為減少菌體由種子液到發酵培養基中溫度帶來的影響,將初始培養溫度提高到35 ℃,再緩慢降溫到33 ℃培養。而且發酵罐擁有更大的培養空間以及更好的溶氧環境,為使菌體快速增長,將接種量提高到10%。圖12可以看出,菌體在4 h時便迅速進入對數生長期。發酵罐更高的通氣量和轉速,保證了菌體在對數生長期快速增長時對溶氧的需求,使得菌體在16 h時便達到穩定期,32 h后菌體進入衰亡期。高效液相檢測36 h時Bacillomycin D產量已達到最高值(890.6±20.1) mg/L,再延長發酵時間Bacillomycin D產量不增加且呈下降趨勢,所以選擇36 h放罐最為經濟。優化后的6010培養基,在發酵罐中Bacillomycin D產量相比搖瓶提高了44%,較原始6010培養基提高了1.14倍,且發酵時間相比搖瓶發酵縮短了36 h,這說明發酵罐更好的溶氧條件對菌體次級代謝產物的代謝和積累具有促進作用。

圖12 19 L發酵罐OD600/DO%/pH檢測Fig.12 19 L fermenter OD600/DO%/pH detection

3 結論

麥芽糖漿和玉米漿可以很好的代替葡萄糖和谷氨酸鈉來生產抗菌肽Bacillomycin D,以這些廉價原料為主要的碳氮源的工業化培養基,可以有效的降低發酵成本。通過Plackett-Burman design實驗篩選出影響Bacillomycin D產量的關鍵因素,然后采用響應面法確定最佳工業培養基配方為:麥芽糖漿46 g/L,尿素0.72 g/L,MgSO4·7H2O 0.35 g/L,玉米漿16 mL/L,(NH4)2SO43 g/L,K2HPO47 g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L。在此條件下枯草芽孢桿菌M364發酵抗菌肽Bacillomycin D產量可以達到(620.2±13.9) mg/L,并且在19 L發酵罐中產量達到(890.6±20.1) mg/L,相比搖瓶產量提高了44%,較原始6010培養基提高了1.14倍,同時發酵時間縮短了36 h。因此,本實驗優化后的6010培養基,不僅培養基組分廉價,而且在降低發酵成本的同時提高了抗菌肽產量,并有效的縮短發酵時間,為抗菌肽Bacillomycin D工業化生產提供了實驗依據。