冬蟲夏草水提物HPLC指紋圖譜及模式識別分析

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(1.貴州師范大學生命科學學院,貴州貴陽 550025;2.中山大學生命科學學院,廣東廣州 510275;3.貴州師范學院化學與生命科學學院,貴州貴陽550018)

冬蟲夏草是一種蟲生子囊真菌,主產于青藏高原海拔3000～5000 m的高寒草甸地區[1],是我國傳統名貴中藥材,具有保肺、益腎、止血、化痰等功效,主要用于腎虛精虧,陽萎遺精,腰膝酸痛,久咳虛喘等癥[2]。由于生長環境嚴苛,生長周期長,加之過度采挖,造成冬蟲夏草資源稀缺,價格昂貴,因此市場上出現了多種混淆品,如蛹蟲草、亞香棒蟲草和冬蟲夏草發酵菌絲體等,它們與冬蟲夏草相似性較高,采用目前《中國藥典》中的性狀鑒別和腺苷含量測定法難以有效區分[3-4],藥材誤用混用現象時常發生,嚴重影響了冬蟲夏草臨床使用的安全性和有效性。因此,建立一種能有效鑒別冬蟲夏草與其類似品的質量評價方法,對規范冬蟲夏草藥材市場十分必要。

中藥HPLC指紋圖譜是一種針對復雜組分的分析方法,根據物質的化學組成特征使用特定方法進行分離并測定,具有同時關注多種成分的特點,比傳統單一成分測定法所得信息更多,更容易尋找到樣品之間化學成分群的微小差異,從而實現藥材的區分鑒定與品質評價[5]。HPLC法具有操作簡便、分析速度快、穩定性好等特點,是目前的中藥材指紋圖譜分析最常使用的方法,采用該方法建立的標準指紋圖譜目前已廣泛應用多種中藥材的質量評價與控制[6-7]。目前已有冬蟲夏草HPLC指紋相關研究多關注冬蟲夏草與其他蟲草屬真菌的真偽鑒別[8-11],較少開展冬蟲夏草與其發酵菌絲體系統比較。

本實驗擬選取19批次冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體,建立冬蟲夏草水溶性成分HPLC特征指紋,利用相似度評價法和化學模式識別法對冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體指紋圖譜進行綜合評價,為冬蟲夏草質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冬蟲夏草樣品 采集自青藏高原典型產區,經中山大學青藏高原研究團隊劉昕教授、張古忍教授鑒定為冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體;冬蟲夏草無性型中國被毛孢(Hirsutellasinensis)菌株C-YS和C-LZ 分離自青海玉樹和西藏林芝自然環境生長的新鮮冬蟲夏草,菌株保藏在中山大學食品與健康工程研究院;冬蟲夏草菌絲體工業發酵產品“百令膠囊” 杭州中美華東制藥有限公司,批號140503,購自廣州市藥店，樣品詳細信息見表1;腺苷、肌苷、胞苷、尿苷、鳥苷、胸腺嘧啶、次黃嘌呤、蟲草素對照品 均購于Sigma-Aldrich公司(純度均≥98%,批號分別為WXBB2139V,016K0037,C122106-1G,SLBD9919V,SLBC0093V,T0376-5G,074K0619,M4030V);甲醇 色譜級,德國Merck公司;實驗用水 為經Millipore Simplicity system處理后的超純水;蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉 英國OXOID公司;葡萄糖、蔗糖 廣州化學試劑廠;馬鈴薯 廣州百佳超市;其他試劑 均為分析純。

表1 冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體樣品來源Table 1 Origins of the O. sinensis and fermentation mycelium

高效液相色譜系統(1525二元泵-2996光電二極管陣列檢測器(Photodiode Array Detector,PDA)) 美國Waters公司;Simplicity型超純水系統 美國Millipore公司;5415R型冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司;DK-8D型恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;SB-3200型超聲波清洗器 上海新芝生物技術研究所;BP211D型密電子分析天平 德國Sartorius公司;QL-901型渦旋振蕩儀 江蘇海門其林貝爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冬蟲夏草菌絲體制備 取適量保存菌種接種到固體種子培養基(馬鈴薯300 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物1 g/L,瓊脂粉15 g/L),于18 ℃培養30 d后,接種到液體培養基中(馬鈴薯300 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物1 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4(7H2O 0.5 g/L),120 r/min,18 ℃培養20 d即為液體種子。吸取5 mL液體種子接種到培養基(蔗糖50 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物3 g/L),120 r/min,18 ℃培養40 d。發酵結束后,使用低壓抽濾法收集菌絲體。菌絲體用超純水清洗3次以上,再經冷凍干燥后,研磨成細粉密封保存備用。

1.2.2 色譜條件 Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,流動相為甲醇(A)-0.3%乙酸溶液(B),梯度洗脫(0～10 min,0% B;10～20 min,0%～8% B,20～30 min,8%～20% B;30～40 min,20% B),流速1.0 mL·min-1,進樣量20 μL,柱溫25 ℃,檢測波長260 nm。

1.2.3 對照品溶液制備和線性關系考察 分別取對照品腺苷、肌苷、胞苷、尿苷、鳥苷、胸腺嘧啶、次黃嘌呤、蟲草素各15 mg,加入適量去離子水溶解樣品,定容至25 mL,配成濃度分別為100、75、50、25、10、5、1、0.5 μg/mL 的混合對照品溶液,過0.45 μm濾膜后,按照1.2.2項下方法進行HPLC測定,每個濃度重復檢測3次。以色譜峰積分面積為縱坐標,標準液濃度為橫坐標,進行線性回歸分析。

1.2.4 供試品溶液制備 稱量已研磨成細粉的冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體樣品0.25 g,加入超純水10 mL,稱量總質量,于50 ℃,30 kHz超聲提取40 min,放置至室溫,用水補足損失重量,混勻,過0.45 μm濾膜,即得。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 精密度實驗 取S4號冬蟲夏草供試品,按照1.2.4項下方法制備供試品溶液,按照1.2.2項下的方法連續進樣6次,記錄HPLC指紋圖譜,計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.5.2 穩定性實驗 取S4號冬蟲夏草供試品,按照1.2.4項下方法制備供試品溶液,分別在0、2、6、12、18、24 h后按照1.2.2項下的方法進行檢測,記錄HPLC指紋圖譜,計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.5.3 重復性實驗 取S4號冬蟲夏草供試品,按照1.2.4項下方法制備供試品溶液,平行6次試驗,按照1.2.2項下的方法分別進樣記錄每份樣品的HPLC指紋圖譜,計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.2.5.4 加樣回收率實驗 取已知胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷含量的冬蟲夏草供試品(S4號)6份,加入超純水9 mL,再加入200 μg/mL混合對照品溶液1 mL,按1.2.4項下方法制備供試液,按1.2.2項下的色譜條件進行測定,計算加樣回收率。

1.3 數據處理

采用中藥《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A版)進行冬蟲夏草指紋圖譜相似度計算。采用SPSS 22.0軟件進行系統聚類分析和t檢驗,采用SIMCA-P 13.0軟件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

根據不同濃度混合對照品色譜峰積分面積計算得到胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷的線性回歸方程分別為y=38761x+2403,y=44565x+3085,y=32631x+2924,y=52077x+1884.6和y=88285x+5120,各待測成分的線性相關系數均大于0.999,表明在濃度為0.5～100 μg/mL范圍內曲線線性關系良好。

2.2 方法學考察

精密度實驗所得圖譜相似度均大于0.999,各共有峰的相對保留時間RSD為0.21%～1.00%,相對峰面積RSD為0.87%～2.99%;穩定性實驗所得圖譜相似度均大于0.999,各共有色譜峰相對保留時間RSD為0.38%～0.97%,相對峰面積RSD為0.99%～3.04%;重復性實驗所得圖譜相似度均大于0.995,各共有峰的相對保留時間RSD為0.29%～1.05%,相對峰面積RSD為1%～3.16%;加樣回收率實驗結果顯示,胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷的加樣回收率分別為101.48%±2.89%,103.36%±1.43%,103.96%±2.45%,107.23%±2.92%和104.67%±2.38%,RSD分別為2.84%,1.38%,2.36%,2.72%和2.27%。結果表明儀器的精密度良好,方法重現性較高,供試品溶液在24 h內保持穩定,符合指紋圖譜的要求。

2.3 冬蟲夏草HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

2.3.1 指紋圖譜建立與共有峰標定 取10批冬蟲夏草樣品,按照1.2.4項下方法制備供試品溶液,再按照1.2.2項下的方法進行檢驗,記錄其色譜圖,導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A版),樣品匹配色譜圖見圖1。以S4號樣品的HPLC圖譜作為參照圖譜,采用中位數法生成冬蟲夏草對照指紋圖譜,共獲得18個共有峰,并指定出其中5個共有峰,分別為胞苷(5號峰),尿苷(9號峰),肌苷(12號峰),鳥苷(13號峰)和腺苷(14號峰),見圖2。每批樣品共有峰面積均占總色譜峰面積的90%以上,滿足指紋圖譜分析要求。以分離度較好、峰面積較大且保留時間適中的9號峰為參照峰,分別計算10批冬蟲夏草共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積,結果顯示各批樣品共有峰相對保留時間RSD為0.424%～5.572%,相對峰面積RSD為18.858%～116.12%,見表2、表3。

圖1 10批冬蟲夏草樣品的HPLC指紋譜Fig.1 HPLC fingerprints of 10 batches of O. sinensis

圖2 冬蟲夏草HPLC 對照指紋譜Fig.2 Common mode of HPLC fingerprints of O. sinensis注:5.胞苷;9.尿苷(參照峰);12.肌苷;13.鳥苷;14.腺苷。

表2 10批冬蟲夏草HPLC指紋圖譜中共有峰相對峰面積Table 2 Relative peak area of common peaks in 10 batches of O. sinensis

表3 10批冬蟲夏草 HPLC 指紋圖譜中共有峰相對保留時間Table 3 Relative retention time of common peaks in 10 batches of O. sinensis

2.3.2 指紋圖譜相似度評價 取9批不同來源的冬蟲夏草菌絲體樣品,按照1.2.4項下方法制備供試品溶液,再按照1.2.2項下的方法進行檢驗,記錄樣品色譜圖,導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A 版),以冬蟲夏草對照指紋為參照譜進行多點校正,匹配后共獲得9個共有峰,共指認出其中5個共有峰,分別為胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷,圖3為匹配后色譜圖。9批冬蟲夏草菌絲體中主要色譜峰為尿苷、鳥苷和腺苷,而冬蟲夏草中含量較高的肌苷微量存在于菌絲體中,表明肌苷可能是冬蟲夏草區別于菌絲體的特征性成分。以4號峰為參照峰計算得到9批冬蟲夏草菌絲體共有指紋峰相對峰面積RSD為26.162%～65.246%,見表4。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統計算19批冬蟲夏草及其菌絲體的相似度,結果見表5。與對照指紋圖譜相比,10批冬蟲夏草的相似度為0.964～0.993,而9批冬蟲夏草菌絲體的相似度為0.563～0.693,表明冬蟲夏草菌絲體與冬蟲夏草水溶性成分存在較大差異,根據指紋圖譜特征可進行有效區分。

表4 9批冬蟲夏草菌絲體 HPLC 指紋圖譜中共有峰相對峰面積Table 4 Relative peak area of common peaks in 9 batches of cultivated mycelium

表5 冬蟲夏草及冬蟲夏草菌絲體樣品相似度評價結果Table 5 Similarities of fingerprints of 19 batches O. sinensis and cultivated mycelium

圖3 9批冬蟲夏草菌絲體的HPLC指紋譜Fig.3 HPLC fingerprints of 9 batches of cultivated mycelium注:2.胞苷;4.尿苷(參照峰);5.肌苷;6.鳥苷;7.腺苷。

2.3.3 含量測定結果 按照外標法計算19批樣品中胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷含量,結果見表6。將所有樣品分為冬蟲夏草和菌絲體兩個組進行獨立樣本t檢驗,結果顯示冬蟲夏草中肌苷和尿苷含量顯著高于冬蟲夏草菌絲體,腺苷含量顯著低于冬蟲夏草菌絲體,胞苷和鳥苷含量在兩組樣品之間無顯著差異。

表6 19批冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體中胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷含量測定結果(mg/g)Table 6 Determination results of cytidine,uridine,inosine,guanosine and adenosine in 19 batches of samples(mg/g)

2.4 模式識別分析

2.4.1 主成分分析 利用SIMCA-P 13.0軟件,以冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體色譜圖中的18個共有峰積分面積為變量對樣品進行主成分分析。前3個主成分方差貢獻率分別為56.6%,26.6%和7.53%,累積方差貢獻率達90.7%,因此提取前3個主成分對樣品進行分析,結果見圖4。冬蟲夏草與冬蟲夏草菌絲體在主成分得分圖上分為3類,冬蟲夏草單獨為1類(S1～S10),S11～S16號冬蟲夏草菌絲體為1類,S17～S19號發酵產品百令膠囊為1類。

圖4 冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體主成分得分圖Fig.4 PCA score scatter plot of O. sinensis and cultivated mycelium

2.4.2 聚類分析 運用SPSS 22.0軟件,以冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體色譜圖中的18個共有峰積分面積為變量,進行Z得分標準化處理后,采用組間平均數聯結法,以歐氏距離為樣品親疏關系度量標準進行聚類分析,結果見圖5。當距離為16時,所有樣品分為3類,其中冬蟲夏草為1類(S1～S10),實驗室培養冬蟲夏草菌絲體為1類(S11～S16),工業發酵菌絲體產品為1類(S17～S19)。聚類分析結果與主成分分析結果基本一致,能夠實現基于指紋特征的樣品分類。

圖5 冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體聚類分析樹狀圖Fig.5 Dendrogram of cluster analysis of O. sinensis and cultivated mycelium

3 結論

本研究采用HPLC指紋圖譜結合相似度評價、化學模式識別方法對不同來源冬蟲夏草進行分析,對19批冬蟲夏草和冬蟲夏草菌絲體進行綜合評價,從化學層面揭示了冬蟲夏草與其發酵菌絲體之間的內在品質差異,為冬蟲夏草質量評價提供一種有效方法。不同產地批次冬蟲夏草指紋一致性較高,表明所含化學成分基本相同;冬蟲夏草與冬蟲夏草菌絲體指紋相似度較低,共有成分中肌苷、腺苷和尿苷含量差異顯著,它們可能是導致兩組樣品區分的重要特征成分。本研究只對冬蟲夏草水溶性指紋中核苷類成分進行了指認,而提取物中其他化合物的表征和其對冬蟲夏草質量的影響,有待進一步研究探討。