白及中四類糖的定量檢測

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(1.曲靖師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,云南曲靖 655011;2.云南煜欣農(nóng)林生物科技有限公司,云南曲靖 655500)

白及(Bletillastriata(Thunb.exA.Murray)Rchb.f.)是蘭科(Orchidaceae)白及屬(Bletilla)植物,也叫連及草、地螺絲、白雞兒、白根、白給等,植株高18～60 cm。白及的初生假鱗莖為圓球形,長大到一定程度的假鱗莖為扁球形,上有荸薺似的環(huán)帶狀,含有大量的黏膠質(zhì),富粘性。白及假鱗莖(塊莖)是我國傳統(tǒng)的中藥材,藥用歷史極為悠久,歷代中醫(yī)藥書籍中都有記載。白及味苦、甘、澀,性微寒,入歸肺、肝、胃經(jīng),在咳嗽、肺結(jié)核等病方中大量使用,其主要功能是斂瘡止血、補肺、消腫生肌等[1-2]。

白及鱗莖中含有大量水溶液性多糖,其化學(xué)成分為吡喃型葡萄甘露聚糖,重均分子量 Mw=9.545×104g/mol,數(shù)均分子量 Mn=7.297×104g/mol[3]。劉福強等[4]采用PMP 衍生化-高效液相色譜法、紅外吸收光譜(FT-IR)和13C核磁共振譜(13C-NMR),對白及多糖的結(jié)構(gòu)的研究表明,白及多糖主要由β-1,4-甘露糖和β-1,4-葡萄糖組成,二者比例為3.5∶1。洪彤彤等[5]研究得出,水提醇沉所得白芨粗多糖中總糖含量為67.62%,收率為 34.70%。白及中多糖含量較高、無毒,具有保濕、減少刺激性、保護皮膚、延緩皮膚衰老之功效,作為食品添加劑或原料,具有較高的安全性和獨特性能[6]。白及粗多糖不但是優(yōu)良的天然食品增稠劑,還有很好的成膜性,在果蔬保鮮方面也有潛在的應(yīng)用開發(fā)價值。隨著對白及粗多糖的認識,其在食品工業(yè)或化妝品領(lǐng)域用途將更加廣泛。

關(guān)于白及中粗多糖定量檢測,目前還未見報道。也缺乏非還原低聚糖和含淀粉原料中粗多糖的檢測方法標準。已有白及多糖含量檢測相關(guān)的報道[7-10],其試驗方法沒有考慮到白及假鱗莖中含有淀粉,所以報道的多糖包含淀粉,如何定量檢測含淀粉原料中粗多糖含量仍有待探索。為此,本實驗以白及為對象,開展了還原糖、非還原低聚糖、淀粉、粗多糖的定量檢測方法研究,旨在檢測白及中的各種糖類含量,為評價白及質(zhì)量提供檢驗方法,同時也為探索適合于含淀粉原料中粗多糖及非還原低聚糖的定量檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白及 云南煜欣農(nóng)林生物科技有限公司藥材種植基地提供;α-淀粉酶(≥3700 U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;魔芋苷露聚糖(純度≥98.0%) 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉等試劑 均為分析純。

TU-1810型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;LD-4型臺式離心機 常州天瑞儀器有限公司;QL-866型漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;AL204-IC型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PS-40型超聲波清洗機 深圳市超藝達科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的預(yù)處理 新鮮白及原料洗凈,切片,80 ℃熱風(fēng)干燥后,粉碎過60目篩,使用前以105 ℃烘至恒重。

1.2.2 檢樣預(yù)處理 在50 mL離心管中精密稱取1 g白及粉,加5 mL純水潤濕,漩渦振蕩1 min,于240 W,20～30 ℃超聲儀中超聲3 min,使之充分潤均,加入無水乙醇20 mL(乙醇濃度達到80% vol)。旋渦振蕩5 min,240 W,20～30 ℃超聲儀中超聲20 min,再離心15 min(4500 r/min),上清液倒入100 mL錐形瓶中。固體同法浸提兩次(加水后充分分散,然后加無水乙醇),合并上清液,離心管中得固體A。上清液用沸水浴、氮吹除去乙醇,再用水溶解,轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶,加水定容(錐形瓶用水洗滌三次,并轉(zhuǎn)入容量瓶),過濾(前10～20 mL棄之),收集濾液得樣液A。取50.00 mL樣液A到100 mL錐形瓶中,加入5 mL鹽酸(1+1),沸水浴加熱1 h,冷卻后加2滴甲基紅指示劑,用氫氧化鈉(200 g/L)中和至中性(剛好變黃色),轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶(洗滌錐形瓶兩次,液體轉(zhuǎn)入容量瓶),定容,得樣液B。

固體A用50 mL純水洗出轉(zhuǎn)移到250 mL錐形瓶中,煮沸,冷卻后加入20 mL淀粉酶溶液(淀粉酶溶液(5 g/L)),55～60 ℃水解1 h,然后取1滴加入1滴碘溶液,檢測不顯藍色(如果顯藍色則按GB5009.9-2016中規(guī)定方法處理)。轉(zhuǎn)入到250 mL容量瓶中,加純水定容,混勻,過濾,棄去初濾液。取過濾清液50 mL,放入100 mL錐形瓶中,于80 ℃鼓風(fēng)干燥箱中除去水分,加入5 mL純水溶解,再加入無水乙醇20 mL,旋渦振蕩分散,于240 W,20～30 ℃超聲儀中超聲10 min,轉(zhuǎn)入50 mL離心管,離心15 min(4500 r/min),上清液倒入100 mL錐形中。殘留固體再加5 mL純水旋渦振蕩分散后加20 mL無水乙醇洗滌,同法超聲、離心,合并上清液至錐形瓶,離心管中得固體B。上清液用沸水浴加熱除去乙醇,加50 mL純水,5 mL鹽酸(1+1),沸水浴1 h,冷卻后加2滴甲基紅指示劑,用氫氧化鈉(200 g/L)中和至中性,轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶(洗滌錐形瓶三次,液體轉(zhuǎn)入容量瓶),定容得樣液C。固體B用水溶解,轉(zhuǎn)入到250 mL容量瓶,定容,離心15 min(4500 r/min),得樣液D。

1.2.3 還原糖及非還原低聚糖的測定 分別取1.2.2中得到的樣液A、樣液B參考GB5009.7-2016中直接滴定法檢測還原糖,并分別記為X1、X2。

參照GB5009.8-2016中第二法,計算蔗糖的方法計算非還原低聚糖,公式如下。

非還原低聚糖含量(%)=(X2-X1)×0.95

為了比對檢驗方法的可靠性,另外按GB5009.7-2016第一法中的原料處理方法處理白及粉,并檢測其還原糖含量,記為X3。同時也考查了該方法檢測的回收率。

1.2.4 淀粉及粗多糖含量的測定 取樣液C按GB5009.9-2016中第一法檢測淀粉含量,記為X4。按照SN/T4260-2015中方法繪制標準曲線。以吸光度為縱坐標,葡萄糖質(zhì)量(μg)為橫坐標,得到葡糖糖標準曲線方程為Y=0.0100X+0.0003,R2=0.9953。取樣液D按照SN/T4260中苯酚-硫酸法檢測粗多糖含量,記為X5。

1.2.5 回收率試驗 精密稱取白及原料0.3 g、標樣葡萄糖0.05 g,檢測還原糖的回收率;精密稱取白及原料0.3 g、標樣蔗糖0.05 g,檢測非還原低聚糖回收率;精密稱取白及原料1 g、標樣淀粉0.2 g、標樣魔芋葡甘聚糖0.1 g,檢測淀粉、粗多糖回收率。精密稱取白及1 g、標樣葡萄糖0.05 g、標樣淀粉0.2 g、標樣魔芋葡甘露聚糖0.1 g,考查多糖對還原糖回收率的影響。試驗方法同1.2.2、1.2.3、1.2.4。

回收率(%)=(檢測得到的糖質(zhì)量-白及原料中的糖質(zhì)量)/標樣的質(zhì)量×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

還原糖含量均以葡萄糖計。還原糖含量精密度控制在重復(fù)性條件下,測得的三次獨立測試結(jié)果的極差值不大于平均值的5%。淀粉、粗多糖含量精密度控制在重復(fù)性條件下,測得的三次獨立測試結(jié)果的極差值不大于平均值的10%。采用三次獨立測試的平均值為試驗結(jié)果值。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖及非還原低聚糖

低聚糖在GB/T 22491-2008、GB/T 23528-2009中都規(guī)定采用高效液相色譜儀進行檢測,制約了低聚糖檢測的推廣。采用80% vol乙醇提取后,除去乙醇,再用水定容,過濾,定容液中的糖就只含單糖、雙糖、低聚糖。將還原性低聚糖計入還原糖類中,沒有還原性的低聚糖類界定為非還原低聚糖。低聚糖的糖苷鍵具有部分縮醛結(jié)構(gòu),可通過酸催化水解得到單糖。通過直接檢測定容液,可知還原糖含量,另再取等量定容液經(jīng)酸水解后檢測還原糖,其差值就是非還原低聚糖。

還原糖和非還原低聚糖含量檢測結(jié)果如表1所示,按GB 5009.7中方法檢測的還原糖及回收率如表2所示。由表1～表2可知,可溶于80% vol乙醇還原糖含量為1.37%。以GB 5009.7標準中方法檢測出的還原糖含量為1.43%。兩種方法的差值為0.06%,是兩種方法平均值的4.29%,兩種方法檢測結(jié)果符合標準中規(guī)定的精密度,說明實驗設(shè)計的檢測方案結(jié)果符合要求。

表1 還原糖和非還原低聚糖含量檢測結(jié)果Table 1 The content detected results of reducing sugar and non-reducing oligosaccharides

表2 按GB5009.7中方法處理原料檢測的還原糖及回收率Table 2 The content and recovery rate of reducing sugar by GB5009.7

表3為還原糖回收率檢測結(jié)果。由表2～表3可知,表3中還原糖回收率103.41%,是本實驗設(shè)計的試驗方法所得的結(jié)果。與表2中按GB5009.7規(guī)定方法處理原料,檢測所得到的回收率102.01%相比,相差1.4%,t檢驗p=0.282,差異不顯著(p>0.05)。說明本實驗設(shè)計用80%vol乙醇(或水∶乙醇=1∶4)提取后檢測還原糖的方法可行。

表3 還原糖回收率檢測結(jié)果Table 3 The recovery rate result of reducing sugar

表4為多糖對還原糖回收率影響的檢測結(jié)果。用表3還原糖回收率103.41%與表4中還原糖回收率98.14%比較,可知,用80%vol乙醇處理樣品時,淀粉、魔芋葡甘露聚糖含量的增加會影響單糖、低聚糖的提取效果,所以對多糖含量高的原料,應(yīng)增加乙醇提取的次數(shù),確保檢測的準確性。

表4 多糖對還原糖回收率影響的檢測結(jié)果Table 4 The effect of polysaccharideson recovery of reducing sugars

表5表明,加入標樣蔗糖考查非還原低聚糖所得回收率為93.76%,說明檢測和計算方法所得非還原低聚糖含量的結(jié)果是可接受的。

表5 蔗糖回收率檢測結(jié)果Table 5 The recovery rate detected result of sucrose

2.2 淀粉與粗多糖

淀粉及產(chǎn)品為人類提供78%～80%的熱量[11],可被淀粉酶定向水解為葡萄糖。粗多糖分子通式為(C6H12O6)n[12],能溶于冷、熱水,不溶于80%vol以上濃度的乙醇。

表6為淀粉和粗多糖含量檢測結(jié)果,表7為淀粉、粗多糖回收率檢測結(jié)果。由表6～表7可知,淀粉、粗多糖含量的RSD值分別為3.66%、1.73%,精密度符合GB 5009.9、SN/T4260中的要求。淀粉、粗多糖回收率分別為100.36%～102.50%、94.30%～97.66%,也在可接受范圍,說明該試驗方法用于檢測含淀粉原料中的粗多糖及淀粉含量是可行的。白及多糖在醫(yī)療上有廣泛的用途[13-19],其含量的檢測就尤為重要,是評價白及質(zhì)量的重要指標。

表6 淀粉和粗多糖含量檢測結(jié)果Table 6 The content detected result of starch and crude polysaccharides

表7 淀粉、粗多糖回收率檢測結(jié)果Table 7 The recovery rate of starch and crude polysaccharides

3 結(jié)論

本研究定量檢測了白及中還原糖、非還原低聚糖、淀粉、粗多糖的含量。結(jié)果表明,白及樣品中還原糖、非還原低聚糖、淀粉、粗多糖含量為1.37%、4.46%、4.70%、42.50%。還原糖、非還原低聚糖、淀粉、粗多糖的RSD為1.12%、0.67%、3.66%、1.73%,回收率為103.41(98.14)%、93.76%、101.21%、96.16%,符合相關(guān)糖類檢測標準的精密度和準確度要求,說明該方法可用于白及四類糖的定量檢測。所設(shè)計的檢測方案采用實驗室的常規(guī)儀器設(shè)備,依據(jù)此法,一次性處理白及原料,同時完成還原糖、非還原低聚糖、淀粉、粗多糖的定量檢測是可行的,有效地提高了工作效率,適用于相關(guān)部門及企業(yè)經(jīng)常性的對白及中糖類含量的檢測,為其他含淀粉原料中的糖類的檢測提供了參考依據(jù)。