氣相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定香精中22種鄰苯二甲酸酯

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(1.浙江方圓檢測(cè)集團(tuán)股份有限公司,浙江杭州 310018;2.浙江省產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)研究院,浙江杭州 310018;3.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,智能食品加工技術(shù)與裝備國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是通常被稱為塑化劑的一類物質(zhì),從上世紀(jì)30年代開始,它就作為增塑劑并使用在工業(yè)產(chǎn)品中,從而增加塑料制品的透明度,耐久性,彈性和壽命[1-2],其中包括個(gè)人護(hù)理品、藥物、食品包裝、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑等[3]。但是研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸酯具有生物毒性,它會(huì)干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫和神經(jīng)的正常調(diào)節(jié),并具有致突變、致畸性和致癌的特性[4]。由于它的作用與激素相似,并且可以模擬雌激素效應(yīng),因此又被稱作環(huán)境激素。

目前,鄰苯二甲酸酯前處理方法主要有固相萃取法[5],固相微萃取法[6],磁固相萃取法[7]和液液(微)固相萃取法[8]等。其中固相萃取法因其成本低,凈化效果好和操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),成為較為常用的萃取方法。氣相色譜[9-10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]、液相色譜[13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]是鄰苯二甲酸酯主要的測(cè)定方法。但是由于液相色譜的管路本底較高,準(zhǔn)確定量較為困難,氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)成為主要的鄰苯二甲酸酯檢測(cè)方法[16]。香精由多種香料混合而成,常添加于飲料、果凍和餅干等食品當(dāng)中。2011年爆發(fā)的臺(tái)灣飲料塑化劑事件中,就涉及到香精,使得香精的塑化劑問(wèn)題得到社會(huì)關(guān)注。香精內(nèi)部成分復(fù)雜,并且部分香精由油溶性組分組成,致使結(jié)果存在著假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。單四級(jí)桿質(zhì)譜選擇性較差,定量限較高,難以滿足香精中鄰苯二甲酸酯的檢測(cè)要求。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取方式對(duì)香精樣品進(jìn)行前處理,使用氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行測(cè)定,以期降低背景干擾,減小假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn),提高檢測(cè)靈敏度,為實(shí)現(xiàn)香精中22種鄰苯二甲酸酯的快速、準(zhǔn)確分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

22種鄰苯二甲酸酯類混合標(biāo)準(zhǔn)品:鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二異丙酯(DIPrP)、鄰苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、鄰苯二甲酸二丙酯(DPrP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、鄰苯二甲酸二異戊酯(DIPP)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)、鄰苯二甲酸二己酯(DHXP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二正庚酯(DHP)、鄰苯二甲酸二苯酯(DPhP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、鄰苯二甲酸二癸酯(DIDP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP) 原始濃度均為1000 μg/mL,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;16種鄰苯二酸甲酸酯類內(nèi)標(biāo)物:鄰苯二甲酸二甲酯-D4(DMP-D4)、鄰苯二甲酸二乙酯-D4(DEP-D4)、鄰苯二甲酸二異丁酯-D4(DIBP-D4)、鄰苯二甲酸二丁酯-D4(DBP-D4)、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯-D4(DMEP-D4)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯-D4(BMPP-D4)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯-D4(DEEP-D4)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯-D4(BBP-D4)、鄰苯二甲酸二己酯-D4(DHXP-D4)、鄰苯二甲酸二戊酯-D4(DPP-D4)、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯-D4(DBEP-D4)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯-D4(DCHP-D4)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯-D4(DEHP-D4)、鄰苯二甲酸二苯酯-D4(DPhP-D4)、鄰苯二甲酸二正辛酯-D4(DNOP-D4)、鄰苯二甲酸二壬酯-D4(DNP-D4) 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;正己烷、丙酮、乙腈 色譜純,美國(guó)TEDIA公司;40種香精樣品 均來(lái)自浙江省香精生產(chǎn)和銷售公司。

ProElut PSA GLASS固相萃取小柱(1 g,6 mL) 迪馬科技有限公司;硅藻土(Diatomite)、C18、石墨化炭黑(GCB)填料 北京振翔科技有限公司;TSQ Quantum GC 三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀、ST-16R型冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 取1.0 g香精于玻璃離心管中,添加適當(dāng)濃度的內(nèi)標(biāo)物,隨后加入0.5 mL正己烷溶液和5 mL乙腈溶液,渦旋超聲30 min,然后以4000 r/min,4 ℃溫度下,離心5 min,收集上層溶液。再加入5 mL乙腈溶液,按上述操作重復(fù)提取一次,合并上清液加入玻璃試管中,40 ℃下氮吹至2 mL,待凈化。固相萃取小柱依次加入5 mL二氯甲烷和5 mL乙腈,加入待凈化液,隨后用2 mL乙腈潤(rùn)洗玻璃試管并加入到萃取柱中,然后加入5 mL乙腈洗脫樣品,收集全部流出液,40 ℃下氮?dú)獯抵两?加入1 mL正己烷溶解,以備氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析測(cè)定。

1.2.2 氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜條件 色譜條件:色譜柱為DB-17 石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氦氣(99.999%),氦氣流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度為280 ℃;升溫程序:100 ℃為起始溫度,以15 ℃/min升至200 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min升至250 ℃,保持2 min,然后以2 ℃/min升至280 ℃,保持2 min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源,電離能量為70 eV,離子源溫度為250 ℃;GC-MS傳輸線溫度為280 ℃;掃描模式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)和子離子模式(product);Q2碰撞氣為純度是99.999%的氬氣(1.5 mTorr);燈絲電流為50 μA。

1.2.3 定性、定量方法 以正己烷為溶劑配制濃度范圍在3～1000 μg/L之間的標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)保留時(shí)間以及碎片離子定性目標(biāo)物。本研究采用內(nèi)標(biāo)定量,參考溶劑提取率和吸附劑加標(biāo)回收率,根據(jù)保留時(shí)間,DIPrP、DAP和DPrP以D4-DEP為內(nèi)標(biāo),DIPP以D4-BMPP為內(nèi)標(biāo),DHP以D4-DCHP為內(nèi)標(biāo),DIDP以D4-DNOP為內(nèi)標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

平均值、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算采用Microsoft Excel 2007版軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

鄰苯二甲酸酯為弱極性化合物,利用DB-17色譜柱(中等極性柱)的分離性能,通過(guò)優(yōu)化進(jìn)樣口、色譜柱程序升溫和傳輸線的溫度,實(shí)現(xiàn)有效分離目標(biāo)化合物(總離子流圖如圖1所示)。而對(duì)保留時(shí)間相近而不能完全分離的某一些組分,如DAPHE DPrP(保留時(shí)間分別為9.58 min和9.62 min),采用SRM技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)未完全分離的鄰苯組分的定性和定量分析。采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)時(shí),條件的優(yōu)化一般包括母離子、子離子以及碰撞能量等。

圖1 22種鄰苯二甲酸酯的總離子流圖Fig.1 TIC of 22 phthalate esters

在優(yōu)化SRM參數(shù)時(shí),先通過(guò)全掃描方式找出每一組份的保留時(shí)間,選取質(zhì)荷比較大且相對(duì)豐度比較高的特征碎片作為母離子。然后將母離子進(jìn)一步裂解,選取兩個(gè)離子作為子離子,同時(shí)優(yōu)化碰撞能量,以最佳的子離子響應(yīng)值進(jìn)行定性和定量。優(yōu)化后的保留時(shí)間、定性定量離子以及碰撞能量信息如表1所示。

表1 22種鄰苯二甲酸酯類和16種內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間、定性定量離子和碰撞能量Table 1 Retention time,qualitative and quantitative ion pairs and collision energy of 22 phthalate esters and 16 internal standards

續(xù)表

2.2 線性范圍、方法檢出限和定量限

將鄰苯二甲酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成質(zhì)量濃度為3、10、50、100、1000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)行測(cè)試,以每種鄰苯二甲酸酯的定量離子峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定PAEs最低加標(biāo)水平時(shí)的響應(yīng),以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算方法的檢出限(LOD),以10倍信噪比(S/N=10)確定定量下限(LOQ),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 22種鄰苯二甲酸酯的判定系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficients,LOD and LOQ of 22 phthalate esters

從表2可以看出22種鄰苯二甲酸酯在3.0～1000 μg/L范圍內(nèi)線性良好(判定系數(shù)R2為0.9922～0.9997),檢出限為0.3～1.0 μg/kg,定量限為1.0～3.0 μg/kg。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

分別選擇二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙腈和甲醇作為提取溶劑,因很高比例的香精為油溶性物質(zhì),當(dāng)使用二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷為溶劑時(shí),因其具有非極性,會(huì)有大量油溶性成分提出,很難進(jìn)行進(jìn)一步處理。比較甲醇和乙腈這兩種極性提取溶劑時(shí),發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效率明顯弱于乙腈(圖2),因此采用乙腈作為主提取溶劑,同時(shí)為了減少油溶性雜質(zhì)被乙腈提取出,故本試驗(yàn)采用正己烷作為輔助提取溶劑。

圖2 提取劑對(duì)鄰苯二甲酸酯類化合物回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on the extraction efficiencies of the phthalate esters

2.4 吸附劑的選擇

香精基質(zhì)復(fù)雜,可能包含色素、脂肪、糖類和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)從而污染色譜柱和干擾定量。因此需要選取合適的吸附材料來(lái)凈化樣品。目前常用吸附劑有硅藻土(Diatomite)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18、石墨化炭黑(GCB)和磁碳納米管等。磁碳納米管因?yàn)橹谱鞴に囕^為復(fù)雜[17],并且市面上沒(méi)有現(xiàn)成的固相萃取柱可供購(gòu)買,因此不作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),C18、GCB和硅藻土對(duì)于部分鄰苯二甲酸酯回收率偏低,C18對(duì)DCHP的回收率為59.1%;硅藻土對(duì)BMPP和DHP的回收率分別為59.2%和59.3%;GCB對(duì)DIPrP、DPrP、DBP、DHXP、DEHP、DHP和DCHP的回收率均低于60%,而ProElut PSA GLASS固相萃取小柱對(duì)于這22種鄰苯二甲酸酯回收率為67.1%～96.1%,滿足實(shí)驗(yàn)需求,因此最終確定采用ProElut PSA GLASS固相萃取小柱。

2.5 方法的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差

本實(shí)驗(yàn)在空白香精中添加鄰苯混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)。各被測(cè)組分分別進(jìn)行20、40和200 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平的回收試驗(yàn),按1.2.2實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行前處理,對(duì)每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行6次平行測(cè)定,計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果如表3所示。從表3可以看出:香精中22種鄰苯二甲酸酯的回收率為82.4%～107.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為≤9.1%,表明該方法的回收率較高,精密度較好。

表3 22種鄰苯二甲酸酯在三個(gè)水平下的加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 The recoveries and RSD of 22 phthalate esters at three levels(n=6)

續(xù)表

2.6 實(shí)際樣品分析

采用本文優(yōu)化后的方法,對(duì)40批香精樣品進(jìn)行了測(cè)試,在其中18批香精樣品中檢出鄰苯二甲酸酯,檢出率為45.0%,結(jié)果如表4所示。所有樣品中,只檢測(cè)出3種鄰苯二甲酸酯,分別為DBP,DIBP和DEHP。在18種檢出的樣品中,主要污染物為DBP和DIBP,而DEHP的含量較低或者為未檢出。根據(jù)《衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于通報(bào)食品用香精香料適用鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)最大殘留量有關(guān)問(wèn)題的函》(衛(wèi)辦監(jiān)督函[2011]773號(hào))中的規(guī)定,香精香料的限量標(biāo)準(zhǔn)為60 mg/kg。因此這18個(gè)樣品均未達(dá)到限量標(biāo)準(zhǔn),并不構(gòu)成嚴(yán)重的塑化劑污染風(fēng)險(xiǎn),但是香精作為食品添加劑,普遍添加于各種食品中,而塑化劑被稱為環(huán)境激素,對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響,特別是幼兒以及兒童,因此香精中鄰苯二甲酸酯較高的檢出率,應(yīng)受到足夠的關(guān)注。

表4 香精中22種鄰苯二甲酸酯的檢測(cè)結(jié)果Table 4 The results of 22 phthalate esters

3 結(jié)論

本研究建立了氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定香精中22種鄰苯二甲酸酯,采用內(nèi)標(biāo)法定量。該方法擁有良好的樣品凈化效果且前處理方法簡(jiǎn)單,精密度、準(zhǔn)確度均能滿足日常檢測(cè)需求,適合大批量檢測(cè)香精中的22種鄰苯二甲酸酯。由于本方法采用了串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜,有較高的選擇性和靈敏度,可以有效的避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生。在實(shí)際樣品檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),雖然鄰苯二甲酸酯含量不高,低于衛(wèi)辦監(jiān)督函[2011]773號(hào)中的規(guī)定,但是檢出率較高(45.0%),由于鄰苯二甲酸酯的生物危害性,所以應(yīng)該得到足夠的關(guān)注。