細胞膜固相色譜法篩查奶粉中AGEs特異結合成分

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(1.南京市產品質量監督檢驗院,江蘇南京 210028;2.中國藥科大學中藥學院,江蘇南京 211198)

食品中的晚期糖基化終產物(advanced glycosylation end products,AGEs)是還原糖和蛋白質、脂肪等通過美拉德反應形成的一類穩定的產物[1],常見于咖啡、可樂、巧克力、麥芽制品、濃縮乳或經熱加工的乳制品以及肉類制品等食物中,其含量受加工方式、加工溫度、加工時間及其蛋白質、脂肪、碳水化合物、水分含量的共同影響[2-4]。通過膳食攝入進入體內的過量AGEs具有一定的危害性,可能誘發糖尿病、腎臟疾病、心血管疾病、免疫缺陷、衰老、炎癥等多種疾病[5-6]。AGEs中的成分如羧甲基賴氨酸(carboxymethyl-lysine,CML)、羧乙基賴氨酸(carboxyethyl-lysine,CEL)和吡咯素(pyralline,Pyr)、戊糖苷素、交聯素等已被認為是食品中潛在的有害因子[7]。AGEs的種類繁多,當前食品中AGEs的種類和含量國內報道較少,國內外相關檢測也僅限于以下兩類AGEs檢測方法[8-9]:免疫學檢測法(ELISA法)與儀器檢測法。

細胞膜固相色譜技術是在生命科學和色譜分離技術基礎上交叉形成的一種新興的色譜技術,利用具有親和作用的生物大分子,研究與化學成分間特異性的結合與分離[10]。目前,已廣泛應用于復雜體系中活性成分的篩選[11]。血管內皮細胞上存在很多AGEs特異結合位點,即RAGE受體。AGEs與RAGE結合后,啟動多種信號轉導途徑,如炎癥反應、凋亡反應等,誘導細胞因子的合成與釋放,促進血管內皮功能紊亂,進而引起多種疾病的發生發展[12]。這些病理改變與多種AGEs成分和細胞膜上受體相互作用有關,這為將細胞膜固相色譜技術應用到食品體系中AGEs成分的篩查提供了理論依據。本課題組前期采用人臍靜脈內皮細胞與AGEs交聯成分MG-H1共同孵育,通過解離技術和現代色譜HPLC-DAD方法,檢測到AGEs成分MG-H1與細胞膜上受體特異性結合,結合率隨孵育時間的延長而增加[13]。

牛奶是最早在食品體系中發現食源性AGEs存在的食品[14],而奶粉的生產過程中需要真空加熱干燥,在這個過程中,由于牛奶受熱易發生美拉德反應,近年來研究發現奶粉中含有AGEs成分[15-17]。因此,本文以含晚期糖基化終產物食品奶粉為研究對象,借助細胞膜固相色譜技術和HPLC-MS/MS技術篩查奶粉中AGEs特異性成分,建立快速檢測此類特異性化學成分的分析方法,以期為奶粉中AGEs的監測和控制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氨水、乙醇 分析純,南京化學試劑股份有限公司;正己烷、十水合四硼酸鈉、硼氫化鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;鹽酸 分析純,上海凌峰化學試劑有限公司;檸檬酸 分析純,廣東汕頭市西隴化工廠;甲醇、乙腈、三氟乙酸 色譜純,美國TEDIA公司;實驗室用水 Milli-Q超純水;DMEM低糖培養基、胰蛋白酶(酶活2.5×103U/mg) 江蘇凱基生物技術股份有限公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司;奶粉 3種不同廠家，南京市當地超市;CML標準品(純度98%,CAS號5746-04-3)、CEL標準品(純度96%,CAS號5746-03-2)、Pyr標準品(純度98%,CAS號74509-14-1) 加拿大TRC公司。

Agilent 6495 LC/MS/MS液相色譜質譜聯用儀、Agilent ZORBAX SB C18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)液相色譜柱 美國安捷倫公司;Strata-X-C固相萃取柱 美國phenomenex公司;UGC-24M氮吹儀 北京優晟聯合科技有限公司;XB-80A渦旋振蕩器 海門其林貝爾有限公司;Milli-Q純水機 美國Millipore 公司;Allegra 64R臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司;Anke TDL-40B型低速大容量多管離心機 上海安亭科學儀器廠;150i全能型CO2培養箱 Thermo Electrom公司;二級生物安全柜 美國Labconco公司;LDZX-50KB立式壓力蒸氣滅菌器 上海申安醫療器械廠;HH-60數顯恒溫攪拌循環水浴鍋 國華電器有限責任公司;微量移液器 美國Thermo公司;XDS-1B倒置顯微鏡 重慶光電儀器總公司;Mettler AL204十萬分之一天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;人臍靜脈內皮細胞 江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 根據Hegele和Assar等[18-19]的方法,并稍作修改,對奶粉樣品進行前處理。稱取1 g奶粉樣品置于50 mL帶蓋耐熱試管中,加入10 mL正己烷,充分渦旋1 min,4000 r/min離心10 min,棄去正己烷層,重復上述正己烷脫脂過程3次,40 ℃氮吹至完全揮干正己烷。脫脂后,將樣品中加入10 mL硼酸鈉緩沖液(0.2 mol/L,pH9.2),渦旋混勻后,加入1 mL硼氫化鈉溶液(2 mol/L,用0.1 mol/L氫氧化鈉配制),混勻后4 ℃冰箱放置8 h 進行還原反應。根據Folch等[20]方法,還原反應結束后加入8 mL三氯甲烷-甲醇(2∶1,V∶V)使蛋白質沉淀,于5000 r/min離心10 min后,棄去上清液。在沉淀物中加入8 mL 6 mol/L的鹽酸溶液,置于110 ℃烘箱中,酸解24 h。將酸解樣品取出并冷卻至室溫,用氮氣將酸解液吹干,用超純水再溶解后定容至50 mL,然后用濾紙過濾并收集濾液。分別依次用3 mL甲醇和3 mL水洗凈和活化Strata-X-C固相萃取柱(流速為1 mL/min),取上述濾液過柱,依次用3 mL水和3 mL甲醇洗凈雜質后(流速為0.5 mL/min),用5 mL含體積分數5%氨水的甲醇溶液洗脫(流速為0.5 mL/min),收集的洗脫液經氮吹濃縮至干。

1.2.2 溶液的配制 PBS溶液的配制:氯化鈉:8.0 g;氯化鉀:0.2 g;磷酸氫二鈉:3.49 g;磷酸二氫鉀:0.2966 g。將上述試劑置于燒杯中,加入蒸餾水,玻璃棒攪拌,超聲,至充分溶解,定容至1 L,高溫高壓滅菌(121 ℃,103 kPa)后,分裝后于4 ℃冰箱保存。

奶粉AGEs提取液:取5 mg 1.2.1中固相萃取濃縮后的樣品,溶解于5 mL PBS溶液中,經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,備用。

解離液:10.948 g磷酸氫二鈉,12.911 g檸檬酸,配成1 L溶液,過0.22 μm微孔濾膜,備用。

1.2.3 細胞的培養 復蘇:取保存在液氮中的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC),立即放入37 ℃水浴中,振搖,溶化后裝入15 mL離心管中,加入含100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清的不完全DMEM(低糖)培養基10 mL,37 ℃、2000 r/min下離心2 min,吸去培養基。取得到的細胞懸液,加入75 cm2培養瓶中,另加入4 mL培養基,于37 ℃、5% CO2、95% O2培養箱中孵育。

換液:每隔24 h換一次培養基,吸去原培養基,加入5 mL新培養基,于37 ℃、5% CO2、95% O2條件下孵育。

傳代:細胞長至約90%融合度后,對細胞進行傳代,吸棄原培養基,PBS溶液(pH=7.4)潤洗2～3次,加入0.25%的胰酶1 mL,消化2 min后,加入新培養基洗滌細胞,轉移至15 mL離心管中,2000 r/min下離心2 min,吸棄培養基,再加入1 mL新培養基,移液槍吹打均勻,使用細胞計數板進行細胞計數。取0.5 mL細胞懸液,加入75 cm2培養瓶中,另加入10 mL培養基,于37 ℃、5% CO2、95% O2條件下孵育。

1.2.4 細胞膜固相方法 細胞膜固相化奶粉中AGEs特異結合成分:取1.2.3傳代后長滿的大瓶細胞,使其貼壁正常生長,除去培養基,加入奶粉AGEs提取液,于37 ℃、5% CO2、95% O2條件下孵育60 min,取出孵育液,待測。

未結合成分的洗脫:用PBS洗滌細胞,棄去上清,反復洗滌,取最后一次PBS洗滌液,待測。

細胞膜固相化的奶粉中AGEs特異結合成分解離:貼壁細胞隨即加入解離液,于37 ℃、5% CO2、95% O2條件下孵育30 min,使細胞效應靶點失活,上清液為活性成分解離液,取出,待測。

檢測樣品的制備:取上述所得最后一次PBS洗滌液、內皮細胞膜解離液,另取空白解離液作為對照,所有樣品氮氣吹干。各樣品中加入0.8 mL甲醇,渦旋2 min,使其充分溶解,再次氮氣吹干。加入0.2 mL甲醇復溶,渦旋2 min,11000 r/min離心10 min。取上清過0.22 μm有機相濾膜,進行HPLC-MS/MS檢測。

1.2.5 HPLC-MS/MS鑒定奶粉中AGEs特異結合成分 色譜條件:Agilent ZORBAX SB C18液相色譜柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm);進樣量10 μL;流速為0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;流動相A為含有5 mmol/L三氟乙酸的高純水,流動相B為含有5 mmol/L三氟乙酸的乙腈,梯度洗脫條件:0～3 min,A:95%～88%;3～12 min,A為88%;12～25 min,A:88%～55%;25～26 min,55%～95%;26～30 min,A:95%～95%。

質譜條件:電噴霧離子源(ESI);正離子掃描模式;多反應監測模式(MRM);駐留時間:500 ms;離子源溫度:200 ℃;脫溶劑溫度:380 ℃;脫溶劑氣流速:500 L/h;錐孔氣流速 50 L/h;進樣錐電壓20 V;毛細管電壓:3 kV;脫溶劑氣和錐孔氣為氮氣,碰撞氣體為氬氣。

1.2.6 HPLC-MS/MS測定奶粉中AGEs主要成分含量 采集市場上銷售的三種廠家奶粉樣品,同1.2.1樣品前處理,收集的洗脫液經氮吹濃縮后,復溶于1 mL初始流動相溶液中,過0.22 μm微孔濾膜后,用于HPLC-MS/MS分析。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 細胞膜固相色譜篩查出奶粉中AGEs特異結合成分鑒定結果

本實驗采用奶粉AGEs提取液與人臍靜脈內皮細胞共孵育60 min,PBS洗滌,排除未與細胞膜靶點結合的非活性成分后,加入解離液,使細胞膜靶點失活,解離人臍靜脈內皮細胞膜上被結合的活性成分,HPLC-MS/MS對解離液進行分析。發現PBS最后洗滌液與空白解離液均沒有色譜峰出現,孵育后的解離液有3個色譜峰(圖1)。結果表明,有3個成分為細胞膜固相活性產物,這3個物質可能是奶粉中AGEs主要成分。

圖1 細胞膜固相產物圖譜Fig.1 Chromatogram of the cell membrane immobilized incubation注:A.內皮細胞膜解離液;B. PBS最后洗滌液;C.空白解離液。

3個AGEs主要成分的質譜圖如圖2～圖4。結合食品中已發現的AGEs化學成分的文獻,綜合分析各化合物的色譜保留時間、相對分子質量、碎片離子信息以及相關文獻數據,推測確定了3個化合物,分別為羧甲基賴氨酸(carboxymethyl-lysine,CML)、羧乙基賴氨酸(carboxyethyl-lysine,CEL)和吡咯素(pyralline,Pyr),見表1,結構式見圖5。在正離子模式下,化合物1產生m/z 205分子離子峰,丟失甘氨酸(75)產生碎片離子m/z 130,繼而丟失甲酸(46)產生碎片離子m/z 84,結合文獻[21],推斷化合物1為羧甲基賴氨酸。化合物2也表現出與化合物1類似的裂解行為,故參照化合物1的推導方法,結合文獻,推斷化合物2為羧乙基賴氨酸[21]。化合物3產生 m/z 255分子離子峰,丟失1分子H2O產生碎片離子m/z 237,再丟失1分子H2O產生碎片離子m/z 219,繼而丟失1分子CO2產生碎片離子m/z 175,再分別丟失1分子氨氣(17)和1分子氰化氫(27),產生碎片離子m/z 158和m/z 148,結合文獻[22]推斷化合物3為吡咯素。

表1 HPLC-MS/MS檢測HUVEC細胞共孵育后3個成分特征碎片Table 1 Characterizations of 3 components after incubation with HUVEC cells by HPLC-MS/MS

圖2 細胞膜固相產物1的MS解析譜圖Fig.2 MS/MS fragments of compound 1

圖3 細胞膜固相產物2的MS解析譜圖Fig.3 MS/MS fragments of compound 2

圖4 細胞膜固相產物3的MS解析譜圖Fig.4 MS/MS fragments of compound 3

圖5 細胞膜固相產物的結構式Fig.5 The structures of 3 components after incubation with HUVEC cells

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系、檢出限和定量限 分別配制質量濃度為10、50、100、200、400、800 ng/mL的CML、CEL和Pyr混合標準溶液,進行HPLC-MS/MS檢測。以對照品進樣質量濃度為橫坐標(X),對照品色譜峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得到各物質的線性回歸方程,并對檢出限和定量限進行驗證。CML線性回歸方程為Y=75.19X+1444.57,R2=0.9999,CEL線性回歸方程為Y=121.30X+2019.26,R2=0.9998,Pyr線性回歸方程為Y=27.71X+458.61,R2=0.9992。CML、CEL和Pyr的線性范圍為10～800 ng/mL,相關系數R2均在0.999以上,線性關系良好。分別以信噪比(S/N)=3和信噪比(S/N)=10,得到儀器的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。CML、CEL檢出限為1 ng/mL,定量限為5 ng/mL;Pyr檢出限為3 ng/mL,定量限為7 ng/mL。表明該方法具有較高的靈敏度。

2.2.2 加標回收率與精密度 向奶粉酸解液中加入CML、CEL、Pyr標準溶液,分別設置高、中、低三個加標量,使加標量分別為50、100、200 ng/mL。由于未加標樣品含有一定量的CML、CEL、Pyr(即本底值),因此對未加標樣品和加標樣品均進行HPLC-MS/MS法分析測定,加標回收率(%)=(實測值-本底值)/加標量×100,每個加標量平行測定6次(n=6)。結果見表2,該方法對CML的回收率為93.02%～100.95%之間,相對標準偏差(RSD)為3.62%～5.80%;對CEL的回收率為93.80%～102.62%之間,RSD為2.34～8.97%;對Pyr的回收率為92.38%～100.71%,RSD為1.41%～4.32%。可見該方法對CML、CEL和Pyr均具有良好的回收率和精密度,適合于奶粉類樣品檢測。

表2 CML、CEL和Pyr加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs ofCML,CEL and Pyr(n=6)

2.3 奶粉中CML、CEL和Pyr含量的測定

采集市場上銷售的三種廠家的奶粉樣品,根據細胞膜固相篩查出的奶粉中主要AGEs成分和已經建立的HPLC-MS/MS方法,對三種不同廠家奶粉中CML、CEL和Pyr含量進行測定,每個樣品平行測定3次(n=3),結果見表3。三種廠家奶粉樣品CML、CEL和Pyr均有檢出,幾乎所有樣品中Pyr含量最高,其含量范圍為84.56～97.36 mg/(kg樣品);其次是CML,其含量范圍為23.38～32.68 mg/(kg樣品);CEL含量最少;其含量范圍為12.67～19.76 mg/(kg樣品)。由表中數據可以看出,不同來源的奶粉樣品中AGEs成分含量有所差異。奶粉的加工過程中需要進行真空干燥,不同的加熱溫度與加熱時長會使得奶粉生產加工過程中美拉德反應的程度不同,因此晚期糖基化終產物生成量可能不同,致使不同廠家奶粉中CML、CEL和Pyr含量有所差異。

表3 奶粉中結合態CML、CEL和Pyr含量(n=3)Table 3 Contents of protein-bound CML,CEL and Pyr in milk powder(n=3)

3 結論

本研究通過對奶粉AGEs提取液與血管內皮細胞固相化,發現奶粉中有3個物質為細胞膜固相活性產物,經鑒定,這些物質分別是CML、CEL和Pyr,從而明確了奶粉中主要AGEs成分。利用建立的HPLC-MS/MS方法檢測奶粉中CML、CEL和Pyr含量,CML、CEL檢出限為1 ng/mL,定量限為5 ng/mL,Pyr檢出限為3 ng/mL,定量限為7 ng/mL。該方法對CML的回收率為93.02%～100.95%之間,相對標準偏差(RSD)為3.62%～5.80%;對CEL的回收率為93.80%～102.62%之間,RSD為2.34～8.97%;對Pyr的回收率為92.38%～100.71%,RSD為1.41%～4.32%。通過對三種廠家的奶粉樣品CML、CEL和Pyr含量進行測定,發現奶粉AGEs成分中Pyr含量最高,其次為CML,CEL含量最低。建立的細胞膜固相色譜法聯合HPLC-MS/MS法成功地應用于奶粉中AGEs成分的篩查,具有操作簡便、快速、特異性好等特點。因此,將細胞膜固相色譜技術首創性地引入到食品體系中AGEs成分的篩查,能有效的實施食品中具有潛在危害作用的AGEs成分快速檢出,實現對食品直觀有效的質量控制,具有重要的借鑒意義。