花生四烯酸對秀麗隱桿線蟲紫外輻射損傷的修復作用

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(天津科技大學食品工程與生物技術學院,食品營養與安全教育部重點實驗室,天津 300457)

紫外輻射(ultraviolet radiation,UVR)是太陽輻射的一部分,其輻射能占太陽總輻射的3%～5%。隨著全球氣候的暖化,導致大氣平流層臭氧減少,到達地表的UVR也逐漸增強,這對全球生態環境和人類健康產生了重要影響[1-2]。研究表明,過度的UVR會引起機體DNA損傷、誘導細胞凋亡,甚至導致皮膚癌的發生[3-5]。通常采用減少陽光暴曬、涂抹防曬霜和穿戴防護服等方法以降低UVR導致皮膚癌的發生。而近年來,從天然產物中篩選具有抗UVR功能的物質的研究越來越受到人們的關注[6-8]。研究表明,水飛薊素(silibinin)、綠茶多酚(green tea polyphenols,GTPs)、紅茶浸提液(black tea infusion)、紅茶茶黃素(black tea extract theaflavins)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)等天然產物都具有良好的抗UVR引起的皮膚癌的作用[9-12],而這些物質一般都具有抗炎、抗氧化、DNA修復和免疫調節等生物活性[13-14]。

花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是生物體內分布最廣泛且具有重要生物活性的一種omega-6多不飽和脂肪酸,具有免疫調節、抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤和保護皮膚等多種生理活性[15-17]。但目前有關AA抗UVR的研究尚未見報道。本文通過不同劑量的UVR照射秀麗隱桿線蟲,建立秀麗隱桿線蟲的UVR損傷模型,考察AA對秀麗隱桿線蟲UVR損傷的保護作用,為AA在抗UVR藥品或功能食品中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N2野生型秀麗隱桿線蟲(雌雄同體) 由北京生命科學研究所王曉晨研究員惠贈;E.coliOP50:為尿嘧啶合成缺陷性菌株(不含任何抗性) 由CaenorhabditisGeneties Center(University of Minnesota,CGC)惠贈;五氟尿嘧啶(5-Fu) 美國Sigma公司;花生四烯酸(AA純度98%) 武漢歐米嘉生物醫藥有限公司;瓊脂粉、胰蛋白胨、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙醇等 均為國產分析純。

LB培養基、NGM培養基、線蟲液體培養(S-Medium)的配制參照張媛[18]的方法。

M9緩沖液:KH2PO43 g,Na2HPO46 g,NaCl 5 g,MgSO40.12 g,加入蒸餾水至1 L,121 ℃高壓滅菌20 min。

LDZH-100KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;HPS-160型生化培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;PXS-104連續變倍體式顯微鏡 天津市歐諾儀器儀表有限公司;UVC500-230V型紫外交聯儀 美國Hoefer;TS100型X倒置熒光顯微鏡及照相系統 日本Nikon公司;FE20K型酸度計 梅特勒托利多儀器公司;TGL-18000CR型高速低溫離心機 上海安亭科學儀器廠;MDF-U33V型-80 ℃冷凍冰箱 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 秀麗隱桿線蟲的基本培養 參照Brenner S[19]、王晉[20]等人的方法,秀麗隱桿線蟲置于涂布有E.coliOP50的標準線蟲培養基(NGM)中,20 ℃下培養;E.coliOP50采用LB液體培養基培養。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲的同期化處理 參照Portadelariva[21]、Wan[22]等人的方法對秀麗隱桿線蟲進行同期化處理。

1.2.3 秀麗隱桿線蟲的UVR處理 將同期化的秀麗隱桿線蟲培養至L4期,收集并用線蟲液體培養基(S-Medium)沖洗蟲體3次,轉移至NGM培養板中,保證蟲體無交疊的情況下,在紫外交聯儀中以不同的劑量(0、2、4、5、6、7、8、10 MJ/cm2)UVR處理30 d。

1.2.4 秀麗隱桿線蟲給藥處理 將UVR處理后的秀麗隱桿線蟲分別挑至涂布有不同濃度AA的NGM培養板中(含有12.5 mg/L的5-Fu),20 ℃下培養24 h。每個濃度作3個平行,空白對照以M9緩沖液進行涂布。

1.2.5 秀麗隱桿線蟲壽命的測定 將1.2.3或1.2.4處理后的秀麗隱桿線蟲轉入涂有E.coliOP50的NGM培養板上,20 ℃下培養,每組作3個平行,每個平行20條秀麗隱桿線蟲,每天進行觀察并計數。如用挑針輕觸秀麗隱桿線蟲蟲體,無反應,即判定線蟲死亡。所有受試秀麗隱桿線蟲從UVR處理或給藥處理后轉入NGM培養基上的開始時間記為第0 d。致死率的計算公式如下:

1.2.6 秀麗隱桿線蟲蟲體運動能力的測定 將1.2.4中給藥處理后的秀麗隱桿線蟲轉入涂有E.coliOP50的NGM培養板上,20 ℃培養48 h,挑取狀態相當的秀麗隱桿線蟲置于無E.coliOP50的NGM培養基上,自由運動約2 min后,記錄秀麗隱桿線蟲在20 s內蟲體彎曲的次數作為蟲體運動能力的指標。每個濃度作3個平行,每個平行30條秀麗隱桿線蟲,實驗重復3次。

1.2.7 秀麗隱桿線蟲產卵數的測定 將15條經過給藥處理且生長狀態相當的秀麗隱桿線蟲挑至新的涂有E.coliOP50的NGM培養板上,每個NGM培養板上培養1條,每24 h轉移1次,直至秀麗隱桿線蟲產卵期結束。產卵后的培養板20 ℃下培養24 h后記錄子代數目。每條秀麗隱桿線蟲在產卵期產卵的總和即為該秀麗隱桿線蟲的產卵數。每個濃度作3個平行,實驗重復3次。

1.2.8 秀麗隱桿線蟲細胞內活性氧(ROS)含量的測定 將1.2.4中給藥處理后的秀麗隱桿線蟲轉入涂有E.coliOP50的NGM培養板上,20 ℃培養48 h,用M9緩沖洗滌2次后,轉移至含10 μmol 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)的1 mL M9緩沖液中,20 ℃靜置10 min,瓊脂糖固定秀麗隱桿線蟲,觀察并用熒光顯微鏡拍攝秀麗隱桿線蟲二氯熒光素(DCF)熒光圖像(激發波長488 nm,發射波長510 nm)。

1.2.9 數據處理 采用統計學方法處理數據,實驗平行重復3次,結果以平均值±標準差的形式表示,組間差異顯著性用SPSS 13.0軟件經t檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 UVR對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

不同UVR劑量對秀麗隱桿線蟲壽命的影響如圖1所示。由圖1可知,在0～10 MJ/cm2的照射劑量范圍內,隨著UVR劑量的增加,秀麗隱桿線蟲的致死率也逐步提高,當UVR的劑量為10 MJ/cm2時,在第4 d致死率就達到了100%。2、4、5 MJ/cm2處理組與0 MJ/cm2對照組相比,線蟲致死率達到100%所用的時間差異不大;而6、7、8 MJ/cm2處理組所用的時間差異較大,所以選擇中間劑量的UVR,即7 MJ/cm2進行后續研究。結果表明,UVR會縮短秀麗隱桿線蟲的壽命,UVR劑量越大,壽命越短。已有研究表明,短時低劑量的UVR會引起機體老化,褶皺增多,但隨著劑量的增加和時間的延長,則會引起生殖細胞凋亡和誘導DNA損傷,進而導致其死亡[23]。這與本文研究的結果相一致。

圖1 不同UVR劑量對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.1 The effect of different doses of UVRon the lifespan of C.elegans

2.2 AA對UVR后的秀麗隱桿線蟲壽命的影響

不同濃度的AA對UVR后秀麗隱桿線蟲壽命的影響如圖2所示。由圖2可知,與空白組(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,秀麗隱桿線蟲經7 MJ/cm2劑量的UVR處理后,經不同濃度AA(25～200 μmol/L)干預之后秀麗隱桿線蟲的致死率均有所降低,其中50 μmol/L的AA降低秀麗隱桿線蟲致死率的效果最好,其次為100、25和200 μmol/L。結果表明,AA可以延長秀麗隱桿線蟲的壽命,但并不是簡單的濃度依賴性。由于AA及其代謝產物生物化學性質的復雜性,AA既具有抗氧化、抗腫瘤等生物活性,但也可以通過氧化應激、離子通道激活、線粒體損傷等途徑誘導細胞凋亡[24],因此,AA延長秀麗隱桿線蟲壽命的作用機制還有待于進一步深入研究。

圖2 不同濃度AA對UVR后的秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.2 The effect of different concentrations of AA on the lifespan of C. elegans after UVR

2.3 AA對UVR后的秀麗隱桿蟲運動能力的影響

不同濃度的AA對UVR后秀麗隱桿線蟲運動能力的影響如圖3所示。由圖3可知,7 MJ/cm2劑量UVR處理后的秀麗隱桿線蟲,經不同濃度的AA(25～200 μmol/L)干預之后其運動能力均有所提高。與對照組(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,50 μmol/L和100 μmol/L AA濃度組秀麗隱桿線蟲的蟲體運動能力極顯著提高(p<0.01)且50 μmol/L時運動能力較0 μmol/L提高了63.6%,25 μmol/L AA濃度組顯著提高(p<0.05),但200 μmol/L AA濃度組卻沒有顯著性差異。結果表明,AA可以改善UVR處理后的秀麗隱桿線蟲的運動能力,但與AA的濃度不呈正相關,這可能也與AA及其代謝產物生物化學性質的復雜性有關。

圖3 AA對UVR后秀麗隱桿線蟲運動能力的影響Fig.3 The effect of AA on the bending frequency of C. elegans after UVR注:與對照組(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.4 AA對UVR后秀麗隱桿線蟲產卵能力的影響

不同濃度的AA對UVR后秀麗隱桿線蟲產卵能力的影響如圖4所示。由圖4可知,7 MJ/cm2劑量UVR處理后的秀麗隱桿線蟲,經25～200 μmol/L濃度范圍的AA干預之后其產卵數均有所提高,且隨著AA濃度的增加呈現先增加后降低的趨勢。與對照組(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,100 μmol/LAA濃度組秀麗隱桿線蟲的產卵數顯著提高(p<0.05),50 μmol/L AA濃度組極顯著提高(p<0.01),相比0 μmol/L產卵能力提高了96.6%。結果表明,AA可以增加UVR處理后秀麗隱桿線蟲的產卵數,提高其生殖能力,但與AA濃度也不呈正相關。

圖4 AA對UVR后秀麗隱桿線蟲產卵數的影響Fig.4 The effect of AA on the oviposition rate of C. elegans after UVR注:與對照組(0 μmol/L+7) MJ/cm2相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.5 AA對UVR后秀麗隱桿線蟲細胞內活性氧(ROS)熒光強度的影響

DCF的熒光強度可以反映細胞內ROS的水平,熒光越強,細胞內ROS的水平就越高。同時,壽命的長短也與細胞內ROS水平的高低有著緊密的聯系,ROS水平越高,某些疾病的發生的機率也越大[25]。AA對輻射后線蟲體內ROS熒光強度的影響如圖5所示。由圖5可以看出,7 MJ/cm2UVR處理組(b組,0 μmol/L+7 MJ/cm2)秀麗隱桿線蟲體內的熒光強度最高,其次是50 μmol/L AA給藥組(c組,50 μmol/L+7 MJ/cm2),而空白組(a組,0 μmol/L+0 MJ/cm2)熒光強度最低,因此,秀麗隱桿線蟲細胞內活性氧水平b組最高,c組次之,a組最低。這說明秀麗隱桿線蟲經URV后,有助于其體內的ROS產生。當活性氧自由基的數量超過體內抗氧化防御能力時,自由基代謝失衡,并引起細胞損傷[26-27]。同時根據老齡化的自由基理論,過度的ROS,特別是超氧化物陰離子及其衍生物,會加速其衰老的進程[28]。而AA可以降低UVR后秀麗隱桿線蟲細胞內的ROS水平,減緩衰老速度,延長其壽命,從而對UVR損傷的秀麗隱桿線蟲起到修復作用。

圖5 AA對UVR后秀麗隱桿線蟲體內熒光強度的影響Fig.5 Effect of AA on fluorescence intensity of C. elegans after UVR注:a:0 μmol/L+0 MJ/cm2;b:0 μmol/L+7 MJ/cm2; c:50 μmol/L+7 MJ/cm2。

3 結論

UVR會縮短秀麗隱桿線蟲的壽命,UVR劑量越大,壽命越短;AA能夠提高UVR損傷秀麗隱桿線蟲的壽命、運動和產卵能力,且能降低其體內ROS的水平,表明AA對UVR后的秀麗隱桿線蟲具有一定的保護作用;且AA對秀麗隱桿線蟲UVR損傷的保護作用并不是簡單的濃度依賴型,當AA濃度為50 μmol/L時,這種保護作用最為明顯,但AA對秀麗隱桿線蟲紫外損傷修復的作用機理還有待于進一步深入研究。研究結果為AA在抗UVR藥品或功能食品中的應用提供實驗依據。同時在其今后研究中可以從秀麗隱桿線蟲體內細胞信號通路方向及基因水平等方面入手,對AA抗紫外輻射機制進行更加深層次的研究。