鱈魚皮膠原蛋白肽果汁飲料抗紫外線照射引起的皮膚光老化

,,, , ,

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

皮膚光老化屬于皮膚的外源性老化,長期紫外線輻射將使皮膚中膠原含量減少,加速光老化進程,使得暴露部位皮膚粗糙、褶皺,出現紅斑、色素沉著、表皮增厚等不可逆損傷[1]。皮膚光老化與多種皮膚病密切相關,如光化性角化病、皮膚癌等[2]。因此有效地預防和延緩皮膚光老化已成為人們迫切關注的問題。

研究表明,膠原蛋白活性肽可以有效改善紫外線照射對皮膚的損傷[3-5]。Chen等[6]發現,鱈魚皮膠原蛋白肽通過激活光老化皮膚中的TGF-β/Smad信號通路促進基質膠原的合成,抑制MAPK/AP-1和NF-κB信號通路的激活來抑制膠原的降解,從而緩解紫外線照射引起的皮膚光老化。Pullar等[7]表明,維生素C刺激膠原蛋白合成并協助防止紫外線引起的光損傷。因此,以鱈魚皮膠原蛋白肽和維生素C為主要活性成分開發天然安全、風味口感好,且具有美容保健功效的飲料,具有重要意義。然而,膠原蛋白飲料絕大多數都是由化妝品工業生產,圍繞膠原蛋白肽飲料產品的研究很少,針對其具體作用效果和作用途徑的研究少見報道[8]。

本文中的鱈魚皮膠原蛋白肽果汁飲料(CJD)是以鱈魚皮膠原蛋白肽、水果濃縮汁為主要原料,按照一定的比例復配,制備出橙黃明亮,果香濃郁,酸甜適中,口感爽滑的液體飲料。本實驗通過構建UVA-UVB復合紫外光源誘導的小鼠皮膚光老化模型,灌胃液體飲料,來研究該飲料對紫外線誘導的皮膚光老化模型的皮膚組織和膠原合成等的具體影響,確證其是否具有抗皮膚光老化作用,為從分子生物學角度探討膠原蛋白肽飲料預防和延緩皮膚光老化的機制奠定理論基礎,為相關產品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱈魚皮膠原蛋白肽 純度為84.3%,山東東方海洋科技股份有限公司;蘋果濃縮汁、檸檬濃縮汁 山東安德利集團有限公司;維生素C 河南祥盛食品添加劑有限公司;三氯蔗糖、麥芽糖醇、檸檬酸和檸檬酸鈉 食品級市售;SPF級ICR小鼠 雄性,4～6周齡,18～22 g,北京動物研究所;超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測定測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定測試盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、總蛋白定量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑 均為國產分析純。

MLS-3750高溫高壓滅菌鍋 日本Sanyo株式會社;實驗型超高溫UHT殺菌機 上海達程實驗設備有限公司;紫外光源 UVA紫外燈管,40 W,峰值為340 nm,2只;UVB紫外燈管,40 W,峰值為313 nm,1只 南京華強電子有限公司;UVA型、UVB型紫外單通道強度測試儀 北京師范大學光電儀器廠;OLYMPUS DP70型顯微成像系統 日本OLYMPUS公司;Leica RM2235組織切片機 德國Leica公司;T18型超細組織勻漿機 德國艾卡儀器設備有限公司;BioTek Synergy酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鱈魚皮膠原蛋白肽果汁飲料的制備 鱈魚皮膠原蛋白肽果汁飲料由中國海洋大學食品學院自行研制,主要工藝流程為:將棕色灌裝瓶在高溫高壓滅菌鍋內滅菌(121 ℃,20 min)后,放置紫外下備用;稱取膠原蛋白肽1 kg、蘋果濃縮汁0.8 kg、檸檬濃縮汁0.07 kg、維生素C 6 g,加純凈水完全溶解;配方優選,添加一定比例麥芽糖醇等甜味劑和檸檬酸等酸味劑對其進行調配,加純凈水定至10 L;采用超高溫瞬時殺菌(125 ℃,5 s),而后進行無菌灌裝。

1.2.2 鱈魚皮膠原蛋白肽果汁飲料的測定 多肽含量的測定：采用雙縮脲比色法進行測定[9]。還原糖含量的測定:按照GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測定》中第一法 直接滴定法進行檢測。還原型VC含量的測定：按照GB 5009.86-2016《食品中抗壞血酸的測定》中第三法 2,6-二氯靛酚法進行檢測。微生物檢測：按照GB 4789.2-2010進行產品菌落總數測定；按照GB 4789.15-2016 進行產品霉菌和酵母計數；按照GB 4789.3-2010進行產品大腸菌群計數。

1.2.3 皮膚光老化小鼠模型建立 選取健康的ICR雄性小鼠60只,隨機分為5組:正常對照組(NC)、模型組(MC)、膠原蛋白肽飲料低劑量組(CJD-L)、中劑量組(CJD-M),高劑量組(CJD-H)。CJD-L、CJD-M、CJD-H分別灌胃3.75、7.5、18.75 mL/kg·d(相當于人推薦攝入量的4.5、9、22.5倍)的膠原蛋白肽飲料,NC和MC組灌胃等量的蒸餾水。實驗期間,各組小鼠自由進食和進水。在紫外照射實驗開始前,各組小鼠預防性灌胃2周,第3周開始脫毛并照射紫外線,照射前30 min灌胃,直至實驗結束。其中NC組只灌胃不進行紫外照射。給藥輻照累計達4周后,UVA和UVB累積照射劑量分別是7.62和0.94 J/cm2。

1.2.4 小鼠臟器指數的測定 最后一次紫外線照射結束,小鼠禁食12 h,稱重后摘眼球取血處死小鼠。取出肝臟、腎臟、脾臟和胸腺后用濾紙擦干并立即稱重。根據以下公式計算臟器指數:

肝臟指數(mg/g)=肝臟重量(mg)/體重(g)

腎臟指數(mg/g)=腎臟重量(mg)/體重(g)

脾臟指數(mg/g)=脾臟重量(mg)/體重(g)

胸腺指數(mg/g)=胸腺重量(mg)/體重(g)

1.2.5 小鼠皮膚組織形態學觀測 每日給藥輻照后20 min,觀察并拍照記錄活體小鼠裸露皮膚的表觀狀態。

1.2.6 小鼠皮膚組織HE染色 取小鼠造模裸露處同一部位皮膚置于4%的甲醛溶液中,乙醇梯度脫水,石蠟包埋,將蠟塊連續切為4 μm薄片,脫蠟,常規復水,HE染色。通過顯微鏡觀察各組小鼠皮膚組織的結構特征。

1.2.7 小鼠皮膚中水分含量的測定 取小鼠造模裸露處同一區域的皮膚,剪碎后均勻放置于稱量瓶內,按照GB/5009.3-2016中直接干燥法進行測定[9]。

1.2.8 小鼠皮膚中羥脯氨酸(HYP)含量的測定 采用氯胺T法測定皮膚中羥脯氨酸含量[10]。

1.2.9 皮膚組織中T-SOD、CAT、GSH-Px、MDA的測定 取同一區域的小鼠造模裸露處皮膚,用生理鹽水根據組織的質量比制成10%組織勻漿液,離心(3500 r/min,10 min)后吸收中間層的清液備用,全程保證低溫。根據試劑盒說明書測定皮膚組織勻漿中T-SOD、CAT、GSH-Px的活力,MDA和總蛋白含量。

1.2.10 血清中T-SOD、CAT、GSH-Px、MDA的測定 造模結束后,小鼠摘眼球取血,血液置于37 ℃水浴中放置1 h,室溫下以3500 r/min離心10 min,取血清于4 ℃冷藏備用。根據試劑盒說明書測定血清中T-SOD、CAT、GSH-Px的活力以及MDA含量。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件對各組數據進行單因素方差分析,數據以平均值±標準偏差表示,同時用 LSD 法進行兩兩比較,p<0.05表明組間具有統計學顯著性;p<0.01,表示各組間差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 CJD中營養成分的含量

經過測定，殺菌后每瓶(100 mL)CJD含功效成分：膠原蛋白肽7.8 g，維生素C 54.67 mg。通過衛生學指標檢驗，該飲料符合國家標準，為安全產品。

2.2 CJD對光老化小鼠臟器指數的影響

在動物模型試驗中,肝臟和腎臟指數常用來評價受試物對小鼠的毒副作用[11]。與正常組相比,CJD各劑量組小鼠的肝臟指數和腎臟指數無顯著性差異(p>0.05),說明CJD對小鼠無毒副作用。脾臟在體液免疫和細胞免疫中發揮著重要作用[12]。胸腺是T淋巴細胞發育和成熟的地方,胸腺的萎縮會導致機體的細胞免疫功能降低[13]。因此,脾臟和胸腺指數的變化在一定程度上能反映機體免疫功能的變化。圖1B,MC組小鼠脾臟指數和胸腺指數顯著降低(p<0.01,p<0.05)。與MC組相比,CJD可以呈劑量依賴性提高脾臟指數和胸腺指數,其中CJD中、高劑量組顯著提高脾臟指數(p<0.05),CJD高劑量組顯著提高胸腺指數(p<0.05)。結果表明,CJD能有效防止免疫器官的萎縮,從而提高光老化皮膚小鼠的免疫功能。

圖1 CJD對光老化小鼠臟器指數的影響Fig.1 Effect of CJD on visceral indices注:與正常組相比,##p<0.01,#p<0.05;與模型組相比,**p<0.01,*p<0.05;圖4～圖7同。

2.3 CJD對光老化小鼠皮膚外觀的影響

通過小鼠皮膚的表觀特征,可判斷出紫外線照射下各組小鼠皮膚的損傷狀況。如圖2所示,正常組小鼠皮膚紅潤、光滑,表皮緊貼表面,無皺紋,充滿彈性;而模型組小鼠皮膚紅斑嚴重,干燥粗糙、多褶皺,皮膚增厚變硬,無光澤且脫屑,表明輻照造模成功。實驗組小鼠的皮膚外觀較模型組明顯改善,裸露部分僅有稍許皮膚增厚,且紫外損傷程度隨給藥劑量增加而明顯減輕。CJD低劑量組小鼠皮膚紅斑較重,表皮粗糙,仍有部分褶皺。CJD中劑量組小鼠皮膚紅斑較少,褶皺消失,粗糙干燥現象修復明顯,但膚色暗沉無光澤。CJD高劑量組小鼠皮膚接近于正常組,光滑水潤,富有彈性,略有脫屑。結果表明,CJD對紫外線引起的皮膚光老化具有顯著的防護作用。Fujii等[14]研究發現,富含維生素C的阿米拉提取物和膠原蛋白肽能夠協同抑制皮膚皺紋的形成和水分的流失,這可能是CJD能夠顯著預防和延緩皮膚光老化的原因。

圖2 CJD對紫外線照射小鼠皮膚外觀的影響 Fig.2 Effect of CJD on the clinical signs of UV-irradiation mice skin

2.4 CJD對光老化小鼠皮膚組織形態的影響

由圖3各組小鼠皮膚組織的HE染色結果可以看出,NC組小鼠皮膚中各層結構完整,表皮與真皮連接處緊密。表皮組織細胞排列整齊,分層清晰,表皮層較薄;真皮層中,波浪狀膠原纖維束排列有序且分布均勻,疏密有致,間質散在分布均勻的纖維母細胞。MC組小鼠的皮膚結構紊亂,分層模糊,表皮層不甚完整,呈現不規則增厚,表皮與真皮分界不清;真皮層組織排列紊亂,膠原纖維斷裂,數量大幅減少,且成團嚴重,分布稀疏,有較多的炎性細胞浸潤,這與Hou[5]等研究的紫外線引起的光老化小鼠皮膚的變化特征一致。與MC組相比,CJD各實驗組小鼠的皮膚組織受損程度得到緩解,表皮組織結構比較完整,厚度不一;真皮層纖維排列趨向整齊,結團現象消失,排列有序,纖維斷裂和破碎減少,說明CJD能有效改善光老化小鼠皮膚組織和膠原纖維的受損情況。其中CJD中、高劑量組改善效果最明顯,接近正常組織。

圖3 CJD對皮膚組織形態的影響(200×)Fig.3 Effect of CJD on histological morphology(200×)

2.5 CJD對光老化小鼠皮膚中水分含量的影響

水分對于維持皮膚的飽滿、彈性、光澤起到重要作用。皮膚中水分含量下降,易出現干燥皺紋、粗糙等現象。試驗結果顯示(圖4),模型組小鼠皮膚中水分含量與正常對照組相比下降了24.27%,呈現顯著性差異(p<0.01)。與MC組相比,CJD中、高劑量組顯著提高了皮膚中水分的含量(p<0.05,p<0.01),表明CJD可以有效抑制光老化小鼠皮膚中水分含量的降低。

圖4 CJD對皮膚組織中水分含量的影響Fig.4 Effect of CJD on water content in the skin

2.6 CJD對光老化小鼠皮膚中羥脯氨酸含量的影響

羥脯氨酸是皮膚膠原蛋白中含量豐富且穩定的氨基酸,因此可通過定量測定皮膚中羥脯氨酸含量來反映真皮內膠原的含量,從而評價皮膚衰老的程度[14]。結果顯示,模型組小鼠皮膚中羥脯氨酸含量與正常對照組相比下降了51.86%,呈現顯著性差異(p<0.01)。這表明紫外線照射顯著降低小鼠皮膚中膠原的含量,皮膚趨于老化。CJD各實驗組小鼠皮膚中HYP的含量極顯著高于模型組(p<0.01),低、中、高劑量組Hyp含量分別提高到NC組的76.99%、88.64%和96.06%,劑效關系明顯,其中CJD高劑量組與NC組小鼠皮膚中羥脯氨酸的含量相當。本實驗結果表明CJD能有效地維持膠原的含量,從而有效地抑制紫外線誘導的皮膚老化,這與組織形態學染色的結果一致。研究表明,膠原蛋白肽經口服后,會在皮膚處特異性富集并被利用,膠原蛋白肽通過激活TGF-β/Smad信號通路促進皮膚基質膠原的合成,通過抑制膠原降解過程中關鍵酶的表達來抑制膠原的降解代謝[15-16]。目前已有大量研究表明膠原蛋白肽和維生素C能夠協同上調I型膠原mRNA的表達水平[17]。

圖5 CJD對皮膚中羥脯氨酸含量的影響Fig.5 Effect of CJD on HYP level in the skin

2.7 CJD對光老化小鼠皮膚抗氧化能力的影響

為了進一步探索CJD抗皮膚光老化活性的初步機理,對各組小鼠皮膚組織及血清中的內源性抗氧化物酶的活力和過氧化物的含量進行測定。由圖6可知,MC組小鼠皮膚中T-SOD、CAT和GSH-Px平均活力與NC組相比極顯著下降(p<0.01),分別下降了41.57%、56.77% 和40.90%。這說明紫外線照射會導致皮膚產生較多的自由基,破壞氧化應激反應的動態平衡,導致氧化損傷,從而引起皮膚的光老化。與MC組相比,不同劑量的CJD均能提高抗氧化酶的活力,且具有劑量依賴關系。其中CJD中、高劑量組均能顯著提高T-SOD的活力(p<0.05,p<0.01);CJD各實驗組均能顯著提高CAT的活力(p<0.05);CJD中、高劑量組均能極顯著提高GSH-Px的活力(p<0.01)。結果表明,CJD中、高劑量組與NC小鼠組織中的抗氧化酶的活力相近。MDA是脂質過氧化反應的最終產物,其含量是衡量脂質過氧化和機體組織受氧化損傷程度的重要指標。紫外線輻照會導致皮膚中MDA含量提高,其中MC組小鼠皮膚中MDA含量較NC組極顯著提高(p<0.01);而同時服用CJD可以顯著抑制紫外線誘導的MDA含量的上升(p<0.05)。與MC組相比,CJD中、高劑量組的MDA含量分別降低了41.58%和44.88%。表明CJD具有顯著促進光老化小鼠抗氧化功能的作用,有效防止機體過氧化。

圖6 CJD對光老化小鼠皮膚抗氧化能力的影響Fig.6 Effect of CJD on antioxidant ability of photoaging skin

2.8 CJD對光老化小鼠血清抗氧化能力的影響

由圖7可知,MC組小鼠血清中T-SOD、CAT和GSH-Px活力與NC組相比顯著下降(p<0.05)。與MC組相比,不同劑量的CJD均能提高抗氧化酶的活力,且劑效關系明顯。其中CJD中、高劑量組均能顯著提高血清中T-SOD、GSH-Px和CAT的活力(p<0.05),與NC小鼠活力相近。MC組小鼠血清中MDA含量較NC組顯著性提高(p<0.01),表明紫外線輻照會導致小鼠血清中MDA含量提高;而CJD中、高劑量組小鼠血清中MDA含量較MC組顯著降低(p<0.05),分別降低了26.28%和29.08%。表明CJD能夠提高血清中抗氧化酶的活力,避免機體內過氧化,降低光老化模型小鼠血清中MDA的含量。

圖7 CJD對光老化小鼠血清抗氧化能力的影響Fig.7 Effect of CJD on antioxidant ability of serum

3 結論

鱈魚皮膠原蛋白肽果汁飲料能有效地改善紫外線照射導致的小鼠皮膚光老化,且作用效果呈劑量依賴型關系。該復合飲料顯著提高了光老化小鼠的脾臟指數和胸腺指數(p<0.05),有效地防止免疫器官的萎縮,提高免疫功能;能提高小鼠皮膚和血清中T-SOD、GSH-Px、CAT的活性,降低MDA含量,有效防止機體內過氧化;能有效維持光老化小鼠皮膚中膠原及水分的含量。因此,鱈魚皮膠原蛋白肽果汁飲料能有效改善光老化小鼠皮膚組織的損傷程度,為從分子生物學角度確證膠原蛋白肽飲料預防和延緩皮膚光老化的作用奠定了理論基礎。