食源性免疫活性肽的研究進(jìn)展

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(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730124)

食源性免疫活性肽無(wú)毒、低敏、安全性高且可以調(diào)節(jié)人和動(dòng)物機(jī)體免疫能力,免疫活性肽在人類營(yíng)養(yǎng)健康和疾病調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不可替代的作用,它已逐步加入到新的功能性食品及臨床治療中。人們對(duì)免疫活性肽的研究始于1918年,Jolles等[1]采用胰蛋白酶對(duì)乳蛋白進(jìn)行水解得到免疫活性肽,并證明其具有提高巨噬細(xì)胞吞噬外來(lái)異物的能力，之后國(guó)內(nèi)外的研究者發(fā)掘不同食物源蛋白質(zhì),酶解得到免疫活性肽，并對(duì)其結(jié)構(gòu)及臨床應(yīng)用進(jìn)行深入研究。我國(guó)學(xué)者王廣先等[2]將免疫活性肽應(yīng)用到臨床應(yīng)用中,用于治療肺癌,并取得顯著效果。目前,國(guó)內(nèi)外已將免疫活性肽應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，制備肽類藥品及功能性食品。

食源性免疫活性肽的食源性蛋白質(zhì)大多取自食品加工副產(chǎn)物,這不僅使加工副產(chǎn)物得到綜合利用,創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益,還可降低了環(huán)境污染,其社會(huì)效益與經(jīng)濟(jì)效益并重。因此,本文對(duì)食源性免疫活性肽的新技術(shù)體系與研究方法進(jìn)行分析總結(jié),這對(duì)掌握食源性免疫活性肽的研究現(xiàn)狀、優(yōu)勢(shì)和不足,以及規(guī)劃未來(lái)的研究方向具有指導(dǎo)意義。

1 食源性免疫活性肽分類

食源性免疫活性肽種類眾多,按來(lái)源可分為植物源、動(dòng)物源及微生物源免疫活性肽。

1.1 植物源免疫活性肽

1.1.1 大米免疫活性肽 大米是我國(guó)主要的口糧,但大米附加值低,增值有限。以稻谷加工的副產(chǎn)物米糠為例,日本米糠的綜合利用率達(dá)到100%,同為發(fā)展中國(guó)家的印度也達(dá)到了30%,而我國(guó)米糠的綜合利用率尚不足20%,資源浪費(fèi)嚴(yán)重[3]。所以有效利用加工副產(chǎn)物可以避免浪費(fèi)資源,提高附加值。Takahashi等[4]從大米胰蛋白酶水解物中分離出一個(gè)九肽,其氨基酸序列為Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg(oryzatensin),并證明其具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力、促進(jìn)腸道收縮和抗嗎啡等免疫調(diào)節(jié)作用。卜漢萍[5]采用堿性蛋白酶制備大米免疫活性肽,用201x7型強(qiáng)陰離子交換樹脂對(duì)大米免疫活性肽進(jìn)行分離純化,提高了大米免疫活性肽對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖活性。王璐等[6]通過胰蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶酶解分離純化出的大米肽，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖,其中,分子量180～1000 Da的酶解肽具有最佳的促增殖效果。Xu等[7]研究發(fā)現(xiàn)富硒大米蛋白酶解物可以增強(qiáng)RAW 264.7巨噬細(xì)胞吞噬能力,保護(hù)鉛引起的免疫細(xì)胞毒性,證明大米活性肽對(duì)免疫細(xì)胞具有免疫保護(hù)作用。

1.1.2 大豆免疫活性肽 1970年,美國(guó)就研制出大豆多肽產(chǎn)品,并建成了年產(chǎn)5000 t食用蛋白肽的工廠,日本于20世紀(jì)80年代開展此方面的研究并成功地將其應(yīng)用于食品工業(yè)。我國(guó)于20世紀(jì)80年代后期也相繼開展了對(duì)大豆多肽的研究。楊小軍等[8]研究發(fā)現(xiàn),大豆蛋白酶解物有明顯的刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用,能顯著促進(jìn)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、刺激胃腸道黏膜，提高腸腔分泌免疫球蛋白(sIgA)。余承高等[9]研究發(fā)現(xiàn)高活性大豆肽可對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK cell)活性有顯著增強(qiáng)作用,證明大豆肽對(duì)機(jī)體具有免疫增強(qiáng)作用。左倩等[10]通過對(duì)仔豬灌胃的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了大豆肽能提高腸黏膜免疫功能,上調(diào)免疫相關(guān)基因表達(dá)量,從而提高IgG和sIgA含量,增強(qiáng)仔豬免疫功能,更好促進(jìn)仔豬的健康。

1.1.3 小麥源免疫活性肽 1979年,有研究人員發(fā)現(xiàn)小麥谷蛋白的胃蛋白酶水解液中具有阿片活性的肽類物質(zhì),命名為面筋外啡肽,目前,對(duì)小麥免疫活性肽研究較多的仍然是阿片肽。張亞飛等[11]通過體外淋巴細(xì)胞增殖法，檢驗(yàn)小麥蛋白堿性蛋白酶水解物對(duì)免疫細(xì)胞的增殖作用,證明了小麥免疫活性肽的存在。代卉等[12]采用堿性蛋白酶水解小麥蛋白，得到具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的肽,研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化活性,還可以增強(qiáng)脾細(xì)胞增殖能力和巨噬細(xì)胞的吞噬能力。此后,該課題組進(jìn)一步采用小麥肽對(duì)受環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠進(jìn)行灌胃,證明了小麥肽不僅可以恢復(fù)HC50和脾細(xì)胞增殖,顯著提高抗體生成細(xì)胞含量和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力,還可以增強(qiáng)小鼠血清清除DPPH·和清除·OH的能力[13]。

1.1.4 植物藻類免疫活性肽 海藻和微藻是具有光合作用的海洋生物,藻類食物本身就具有免疫調(diào)節(jié)功能,藻類水解物更是免疫活性肽的重要來(lái)源之一。Morris等[14]將經(jīng)胰蛋白酶水解后的小球藻飼喂給營(yíng)養(yǎng)不良的BALB/c小鼠,發(fā)現(xiàn)其先天性免疫和特異性免疫應(yīng)答均增強(qiáng),包括巨噬細(xì)胞吞噬能力、細(xì)胞介導(dǎo)免疫、依賴T淋巴細(xì)胞的抗體反應(yīng)等。Cian等[15]從一種紅色海藻中酶解得到促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(PCRH),試驗(yàn)證明其可促進(jìn)大鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞抑制因子的產(chǎn)生,從而起到免疫調(diào)節(jié)作用。由于技術(shù)以及藻類本身具有免疫調(diào)節(jié)作用,目前我國(guó)對(duì)藻類免疫活性肽的研究較少,有待進(jìn)一步發(fā)掘研究。

1.1.5 其他植物來(lái)源的免疫活性肽 植物源免疫活性肽種類眾多,除了上述大米、大豆及小麥等食源性免疫活性肽,還有玉米、水果及蔬菜等同樣成為免疫活性肽的重要來(lái)源。玉米源免疫活性肽研究比較多,馬子淇等[16]用單因素及正交法證明胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解物，對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著的促進(jìn)作用,隨后又研究了玉米黃粉免疫活性肽的最佳制備工藝,得出經(jīng)胰蛋白酶水解提取,酶濃度3.0 g/L,底物濃度60 g/L,溫度45 ℃,pH8.0,水解90 min[17],并進(jìn)一步證明大孔樹脂脫鹽純化后的玉米黃粉免疫活性肽，具有促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的能力且有劑量依賴性。通過雙層包埋法將其進(jìn)行包埋制成微膠囊,提高其穩(wěn)定性,便于日后人們使用及工業(yè)化生產(chǎn)。2012年,許金光等[18]用胰蛋白酶酶解軟棗獼猴桃制備多肽并對(duì)其進(jìn)行免疫試驗(yàn),證明軟棗獼猴桃多肽對(duì)小鼠機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫功能有增強(qiáng)作用。2018年,王鵬等[19]酶解榛仁蛋白得到分子質(zhì)量小于3kDa的組分,并采用凝膠色譜及反相高效液相色譜對(duì)其進(jìn)行分離純化,得到了榛仁免疫活性肽序列:Pro-Glu-Asp-Glu-Phe-Arg(pedefr),并證明其對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用,且當(dāng)濃度達(dá)到100.0 μmol/L時(shí),可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖率達(dá)到44.21%,在伴刀豆蛋白A共同作用下,增殖率達(dá)到53.22%。除上述植物源活性肽外,還有學(xué)者從蕎麥[20]、花生[21]等蛋白質(zhì)中制備出免疫活性肽。

1.2 動(dòng)物源免疫活性肽

1.2.1 乳蛋白免疫活性肽 Mercier等[22]研究乳清蛋白及其酶解產(chǎn)物,證明乳清蛋白中含有免疫調(diào)節(jié)肽,表明構(gòu)成免疫活性肽的氨基酸種類、數(shù)量和序列對(duì)其免疫活性有重要影響,強(qiáng)疏水作用能促使免疫活性肽與細(xì)胞膜相互作用從而增強(qiáng)其免疫活性。乳蛋白免疫活性肽,可以調(diào)節(jié)動(dòng)物及人體免疫能力。早在1991年，乳蛋白免疫活性肽就已應(yīng)用到臨床試驗(yàn),并取得顯著效果。Hadden等[23]用注射法將Tyr-Gly和Tyr-Gly-Gly兩種乳蛋白免疫活性肽給93位艾滋病病人用,發(fā)現(xiàn)這兩種肽能提高艾滋病人免疫能力,減緩艾滋病病情惡化,證明免疫活性肽對(duì)人體免疫功能具有增強(qiáng)作用。Miyauchi等[24]報(bào)導(dǎo)了牛乳鐵蛋白基因(LF)的胰蛋白酶水解物也具有免疫調(diào)節(jié)作用。徐鑫等[25]用響應(yīng)面法優(yōu)化了胰蛋白酶酶解酪蛋白酸鈉制備免疫肽的酶解條件,獲得了酶解制備免疫活性肽的最優(yōu)工藝。張奕等[26]從發(fā)酵駝乳中提取出免疫活性肽,并證明其可降低BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞中核因子-кB和白細(xì)胞介素6的表達(dá),同時(shí)明顯升高γ-干擾素、白細(xì)胞介素12和白細(xì)胞介素23的表達(dá),以此對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。乳中蛋白含量豐富,乳蛋白是最富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)之一,也是含免疫活性肽最豐富的蛋白質(zhì)。乳蛋白酶解是目前獲得食源性免疫活性肽的主要來(lái)源,目前對(duì)其研究多在體外進(jìn)行,應(yīng)用于臨床及在體內(nèi)發(fā)揮功效的研究相對(duì)較少,有待深入探究。

1.2.2 鹿茸免疫活性肽 2010版中國(guó)藥典載,鹿茸為鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。姜紅等[27]確定了木瓜蛋白酶水解鹿茸血制備免疫活性肽的最佳酶解條件,酶解得到兩條肽,通過體外活性試驗(yàn)，證明其中一條酶解產(chǎn)物能顯著刺激脾淋巴細(xì)胞增殖,對(duì)·OH和DPPH·有較高的清除作用。張夢(mèng)瑩[28]持續(xù)給予小鼠鹿茸乙醇提取物,發(fā)現(xiàn)能夠一定程度上增強(qiáng)小鼠免疫力,證明了鹿茸乙醇提取物有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。趙磊等[29]通過酶解得到鹿茸蛋白肽,確定了肽的最佳酶解條件,發(fā)現(xiàn)了堿性蛋白酶酶解物VAWP-SGD在無(wú)誘導(dǎo)劑時(shí),對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用,其對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最顯著。

1.3 微生物源免疫活性肽

梁奉軍[38]對(duì)8個(gè)小肽進(jìn)行拼接，設(shè)計(jì)出具有免疫刺激活性的雜合肽,并分別在其C-末端和N-末端添加起始密碼子ATG和釀酒酵母強(qiáng)終止密碼子TAA,導(dǎo)入釀酒酵母,通過對(duì)照試驗(yàn)證明免疫增強(qiáng)型酵母可顯著提高育苗的成活率,對(duì)白化病有很好的免疫增強(qiáng)作用。Morris等[39]采用胰酶水解小球藻制備免疫活性肽,將其飼喂給BALB/c小鼠,發(fā)現(xiàn)小球藻免疫活性肽具有促進(jìn)BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞增殖、提高巨噬細(xì)胞吞噬能力等作用。食用免疫活性肽后的BALB/c小鼠先天性免疫和特異性免疫應(yīng)答均增強(qiáng)。Cian等[40]酶解一種紅色海藻(柱葉帚霉),酶解得到富含Asp、Ala和Glu的高水解蛋白酶解物,將其飼喂給大鼠,證明其可促進(jìn)大鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖,具有較好的免疫活性。

2 食源性免疫活性肽制備方法

2.1 微生物發(fā)酵法制備免疫活性肽

微生物發(fā)酵是利用微生物自身的胞外蛋白酶降解食源蛋白質(zhì)的過程,微生物發(fā)酵工藝根據(jù)底物的不同分為液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種。李善仁等[41]分別采用固態(tài)、液態(tài)發(fā)酵法利用混合菌種制備大豆肽,證明液態(tài)發(fā)酵時(shí)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶水解更充分,更有利于降解豆粕蛋白。其使用發(fā)酵法制備活性肽的目的及優(yōu)勢(shì)在于，可以利用微生物降低或消除食品中存在的苦味。劉旺旺等[42]以不同菌種液態(tài)發(fā)酵羊胎盤殘留物制備活性肽進(jìn)行研究比較,證明分子量大小對(duì)產(chǎn)物的生物活性有一定的影響,并對(duì)各組分進(jìn)行免疫細(xì)胞增殖活性的研究,相同胎盤肽質(zhì)量濃度(100 μg/mL)下,黑曲霉的免疫細(xì)胞增殖活性最高。

微生物發(fā)酵法使用時(shí)間較早且范圍較廣,發(fā)酵產(chǎn)物均勻且風(fēng)味較好,微生物種類、數(shù)量及生產(chǎn)條件對(duì)發(fā)酵效果有至關(guān)重要的作用。但發(fā)酵工藝生產(chǎn)周期長(zhǎng),暫無(wú)統(tǒng)一固定工序流程,因此產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[43]。

2.2 酶水解法制備免疫活性肽

酶水解法制備免疫活性肽,是目前制備生物活性肽的主流方法,其操作條件溫和、易控,需要控制合適的酶和確定所需的時(shí)間、底物濃度、溫度、pH等條件,方便快捷、安全性高。酶解技術(shù)可控制酶切位點(diǎn),控制制備肽的分子質(zhì)量[44]。常用的蛋白水解酶有三類:動(dòng)物蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶等;植物蛋白酶如木瓜蛋白酶及菠蘿蛋白酶等;微生物蛋白酶如細(xì)菌膠原酶等。張銳昌等[45]酶解小麥蛋白制備肽,采用響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶酶解工藝條件,得出最佳條件為是溫度為41 ℃、pH為2.0,底物濃度為3%,加酶量為1500 U/g,酶解時(shí)間為7 h。堿性蛋白酶的最佳酶解工藝是溫度為70 ℃,pH為8.0,底物濃度為3%,加酶量為1200 U/g,酶解時(shí)間為120 min。酶法制備肽適合生產(chǎn)小肽,其成本低,但蛋白酶的水解作用可能會(huì)產(chǎn)生許多副產(chǎn)物,而且缺乏合適的蛋白酶,產(chǎn)率較低。但是綜合考慮成本、技術(shù)的成熟度等因素,酶法水解蛋白質(zhì)生產(chǎn)活性肽具有較高的可行性。鄧志程等[46]通過模擬胃腸消化的方式對(duì)馬氏珠母貝全臟器進(jìn)行酶解,并利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶酶解階段的工藝過程進(jìn)行模擬優(yōu)化,水解馬氏珠母貝并分離純化的兩條二肽Ala-Arg、Val-Arg。它們顯著提高小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力和體液免疫的水平,并極顯著地增強(qiáng)經(jīng)抗原誘導(dǎo)的小鼠免疫應(yīng)答能力。

3 展望

很多食物源蛋白質(zhì)是制備免疫活性肽的良好原料,食品加工生產(chǎn)的副產(chǎn)品和廢料中蛋白質(zhì)含量豐富,這樣既節(jié)約了資源又保護(hù)了環(huán)境。目前,酶水解法制備免疫活性肽為最具有發(fā)展前景的免疫活性肽制備技術(shù),一些問題已隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展得到解決和改善,例如利用復(fù)合酶解決單一酶酶解不完全的問題,但依然存在一定尚未能解決的問題,例如如何對(duì)蛋白肽鍵進(jìn)行靶向性地酶解，仍是蛋白質(zhì)酶解制備活性肽最難解決的核心技術(shù)。相對(duì)于酶解法而言,微生物發(fā)酵的過程中能夠產(chǎn)生多種蛋白酶,微生物蛋白酶具有活性高、成本低的特點(diǎn)。植物原料發(fā)酵副產(chǎn)物可用作飼料,可有效避免浪費(fèi)。所以此方法有待進(jìn)一步深入研究。使用微生物發(fā)酵法,可用廉價(jià)的原料大量生產(chǎn)免疫活性肽,這將對(duì)畜牧業(yè)、糧食加工產(chǎn)業(yè)以及其他相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。此外,隨著研究方法及科學(xué)技術(shù)的不斷提高,未來(lái)將會(huì)有越來(lái)越多的動(dòng)、植物及微生物源免疫活性肽被發(fā)掘并得到深入研究。此外,延長(zhǎng)食源性免疫活性肽的保存時(shí)間、提高其穩(wěn)定性以及利用現(xiàn)代生物技術(shù)預(yù)測(cè)以及制備、合成新的免疫活性肽也是極有價(jià)值的發(fā)展方向,而對(duì)免疫活性肽作用機(jī)理的探究及其安全性評(píng)價(jià)的摸索，更是今后需要深入研究的課題之一,只有在了解其調(diào)節(jié)機(jī)理和進(jìn)行全面的安全評(píng)價(jià)后,免疫活性肽產(chǎn)品才能更好的用于實(shí)踐,今后的研究空間將更加廣闊。