食品中花生過敏原及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

,,Lisa Wang,,*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東濟(jì)南 250353;2.Harmoni International Spice,Inc.,881 S. Azusa Ave,City of Industry 91748,CA)

食品安全在民眾生活中占有不容撼動(dòng)的位置,與人民的生活息息相關(guān)。農(nóng)獸藥殘留、食品添加劑的濫用、致病菌污染等食品問題對(duì)人體健康造成了極大的威脅。在眾多食品問題中,食品過敏問題屢見不鮮。一些特殊體質(zhì)的人極易對(duì)食品中的某些成分發(fā)生過敏反應(yīng),而這些過敏原很難從食品中去除掉,制約了食品的大范圍流通,且對(duì)過敏患者的健康造成了嚴(yán)重威脅。目前食品過敏問題是食品行業(yè)較為嚴(yán)峻的問題。

1995年,聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)認(rèn)定了8種最常見的致敏食物,90%以上的食物過敏反應(yīng)都是由它們引起的。因此,為了消費(fèi)者的安全,一些發(fā)達(dá)國家在食品包裝標(biāo)簽中強(qiáng)制要求標(biāo)識(shí)過敏原成分[1]。我國針對(duì)這一現(xiàn)狀,也出臺(tái)了推薦在食品包裝上標(biāo)識(shí)致敏成分的條款。但是,目前在國際上還沒有出臺(tái)明確統(tǒng)一的對(duì)食品中主要過敏原限量規(guī)定的相關(guān)文件[2-4]。

花生是較常見的重要食物過敏原之一,會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng),并且熱穩(wěn)定性高、能耐酸和耐酶解,一般的生產(chǎn)方式無法去除花生食品的致敏性[5]。目前,正式命名的花生過敏原蛋白有11種,但是有些文獻(xiàn)中也認(rèn)為有13種,除了已經(jīng)命名的11種花生蛋白之外,還有一種花生凝集素以及分子量為18 ku左右的油質(zhì)蛋白[6]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,食品的流通也趨于國際化,花生過敏問題也得到了廣泛關(guān)注。本文主要介紹了酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫印跡法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以及新興的生物傳感器和質(zhì)譜法等對(duì)花生過敏原的檢測(cè)。

1 花生過敏原的種類

1.1 Ara h 1

Ara h 1是最主要的花生過敏原,在花生過敏原中含量最多,約占總花生蛋白含量的12%～16%,屬于豌豆球類蛋白,分子量為63.5 ku?；ㄉ^敏患者的血清90%以上都能夠識(shí)別。在天然狀態(tài)下有單聚體和三聚體兩種,以可溶性蛋白的形式存在[7]。對(duì)于Ara h 1的三聚體形式,是疏水相互作用將三個(gè)單體連接起來形成的同源三聚體糖蛋白,具有很高的穩(wěn)定性,并且可以耐受胃腸道的消化作用,加熱也不會(huì)破壞其過敏性,因此具有很穩(wěn)定的Ig E結(jié)合位點(diǎn),不容易被破壞,過敏反應(yīng)非常強(qiáng)[8]。同時(shí),Cabanos等[9]經(jīng)過研究,確定了Ara h 1三聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,并詳細(xì)描述了其空間結(jié)構(gòu)。Ara h 1中總共有23個(gè)線性Ig E結(jié)合位點(diǎn),與豌豆蛋白相比有40%的相似性。

1.2 Ara h 2

Ara h 2屬于藍(lán)豆蛋白,也是主要的花生過敏原,含量約為花生蛋白總量的5.9%～9.3%,同樣能夠引起90%以上的過敏反應(yīng)。Ara h 2包含Ara h 2.01和Ara h 2.02這兩種遺傳變異體[10],分子量范圍在17～20 ku之間。在72～83號(hào)位點(diǎn)上,Ara h 2.02比Ara h 2.01缺失了12個(gè)氨基酸[11]。由于Ara h 2中二硫鍵較多,所以結(jié)構(gòu)非常的穩(wěn)定,并且耐酶解。如果二硫鍵被破壞,其水解敏感性將顯著增加[12-13]。此外,Ara h 2具有抑制胰蛋白酶的特性,并且熱處理能夠提高抑制能力。但是如果二硫鍵被破壞,其抑制劑活性也隨之降低。Ara h 2中共含有10個(gè)線性Ig E結(jié)合位點(diǎn),并且易與Ara h 1、Ara h 3引起Ig E交叉反應(yīng)[14]。

1.3 Ara h 3

Ara h 3的序列與大豆球蛋白有62%～72%的相似,因此屬于大豆球蛋白,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。有Ara h 3.01 和 Ara h 3.02兩個(gè)同種異形蛋白,分子量分別為60、37 ku[15]。44%以上的花生過敏患者的血清能夠識(shí)別Ara h 3.01。Ara h 3.01可以水解成一個(gè)酸性和堿性的片段,再經(jīng)過胰蛋白酶消化后,形成一些分子量在13～45 ku的片段,其中的IgE的結(jié)合位點(diǎn)可以導(dǎo)致過敏反應(yīng)[16]。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn),Ara h 4與Ara h 3的氨基酸序列90%以上具有同源性,屬于同源過敏原,而且線性IgE結(jié)合位點(diǎn)有4個(gè)相同的[17]。因此,Ara h 4被認(rèn)為是Ara h 3的一種同種異形蛋白,并命名為Ara h 3.02,但是有些人又將兩者統(tǒng)稱為Ara h 3/4[18]。

1.4 其他

不同于以上3種花生過敏蛋白,其它幾種花生過敏原的研究比較少,還沒有詳細(xì)的信息。其中,Ara h 5屬于肌動(dòng)蛋白,分子量為15 ku,肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肌蛋白的結(jié)構(gòu),也可以被肌蛋白所調(diào)節(jié);能抑制纖維形肌動(dòng)蛋白的聚合作用[19-20]。Ara h 6和Ara h 7屬于2S白蛋白,在花生中含量很低,與Ara h 2具有相似性,Ara h 6和Ara h 7與其分別有59%的同源性和35%的相似度,Ara h 6能夠耐高溫和酶解[21-23]。Ara h 6和Ara h 7的分子量都為15 ku,屬于種子貯藏蛋白。Ara h 8屬于病程相關(guān)蛋白,分子量17 ku,熱穩(wěn)定性差,不耐酶解[24]。Ara h 9是一種非特異性的脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,耐酶解、高溫[25]。Ara h 10和Ara h 11分別屬于16 ku油質(zhì)蛋白和14 ku油質(zhì)蛋白,主要來自于花生油脂[26]。Ara h 12的分子量有8、12、5.184 ku三種,Ara h 13同樣有8、11、5.472 ku,屬于防御素。

2 花生過敏原的檢測(cè)方法

由于花生過敏患者只能通過不食用含有花生的食物來避免發(fā)生過敏反應(yīng),所以檢測(cè)食品中花生過敏原蛋白含量的方法尤為重要。目前已經(jīng)有檢測(cè)花生過敏原的方法,如免疫學(xué)中的印跡法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等,以及生物傳感器、質(zhì)譜法等其他檢測(cè)方法。大多數(shù)用于檢測(cè)過敏原的商業(yè)分析工具都依賴于免疫檢測(cè),如ELISA。然而,ELISA和PCR法基于蛋白質(zhì)和基因水平上進(jìn)行檢測(cè),雖然檢測(cè)速度快,但是極易受到污染而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果,從而限制了其應(yīng)用。質(zhì)譜法等儀器檢測(cè)靈敏較高,可以省去繁瑣的提取步驟,并且可以解決提取效率低的問題;還可以滿足直接檢測(cè)目標(biāo)蛋白和變性蛋白的要求;避免了假陽性和假陰性的問題,使用同位素標(biāo)記的特異性肽段作為內(nèi)標(biāo),可以解決其基質(zhì)干擾所帶來的一系列問題。

2.1 ELISA

ELISA利用抗原抗體的特異性反應(yīng)來檢測(cè)花生過敏原,具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、時(shí)間短的特點(diǎn)。ELISA法有夾心法、間接法和競(jìng)爭法,其中常用雙抗夾心和競(jìng)爭法,且最低檢測(cè)限為0.1～1 mg/kg。

雙抗夾心ELISA既能檢測(cè)抗體又能檢測(cè)抗原,是一種常用的檢測(cè)花生過敏原的方法。陳獻(xiàn)雄等[27]使用雙單克隆夾心法檢測(cè)花生過敏原Ara h 1,得到了5 ng/mL的檢測(cè)限,并且在5～80 ng/mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,同時(shí)對(duì)10種食物中的花生過敏原進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果與標(biāo)簽標(biāo)注基本相符,能夠用于快速檢測(cè)食品中的花生過敏原。Janssenduijghuijsen等[28]在調(diào)查影響花生食用后血清中過敏原檢測(cè)的因素時(shí),采用雙單克隆夾心ELISA法檢測(cè)花生主要過敏原Ara h 6的存在和數(shù)量。檢測(cè)結(jié)果表明,該方法靈敏度很高,為使用ELISA方法檢測(cè)食品中的花生過敏原提供了基礎(chǔ)。目前,可以直接從市面上購買專門的ELISA試劑盒來進(jìn)行花生過敏原的檢測(cè)。最常用的有德國拜發(fā)、美國CORTEZ和上海甄準(zhǔn)公司的試劑盒。

競(jìng)爭ELISA是將具有專一性的抗體固著于酶標(biāo)板上,然后加入待測(cè)樣本,使其中的待測(cè)抗原與固著于酶標(biāo)板上的抗體結(jié)合,然后加入辣根過氧化物標(biāo)記的抗原,兩種抗原競(jìng)爭結(jié)合包被抗體,通過顯色可以測(cè)定抗原。也可以使用該方法來測(cè)定抗體。閆飛[29]等使用ELISA檢測(cè)了花生過敏蛋白Ara h 6,IC50為 414.6 ng/mL,在16.5～10000 ng/mL的范圍內(nèi),有很好的線性關(guān)系,并且精確度和重復(fù)性很好。蛋白質(zhì)經(jīng)過加熱之后一級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化,導(dǎo)致檢測(cè)過程中花生過敏原無法被抗體正確識(shí)別,出現(xiàn)假陰性。此外,花生過敏原與其他過敏原之間有較強(qiáng)的交叉反應(yīng),采用抗原抗體技術(shù)也會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng),會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)值偏高和假陽性現(xiàn)象。

2.2 PCR法

PCR法是一種基于檢測(cè)DNA/RNA的方法。一些花生過敏原雖然耐高溫,但是在實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)常要進(jìn)行一系列的高溫處理,會(huì)破壞過敏原的結(jié)構(gòu),而經(jīng)過長時(shí)間高溫高壓的處理后在一定時(shí)間內(nèi)DNA仍能保持完整,因此可以使用PCR法來直接檢測(cè)花生過敏原基因。目前,在花生過敏原的檢測(cè)中最常使用的兩種方法是傳統(tǒng)PCR和實(shí)時(shí)PCR,并且PCR法特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速,對(duì)純度要求比較低,DNA粗制品及RNA均可直接作為擴(kuò)增模板。Dimitra等[30]采集了152份樣品,采用實(shí)時(shí)PCR方法進(jìn)行分析。結(jié)果表明,花生樣品中有125份(83%)呈陽性,并且在84份未標(biāo)明花生過敏原的樣品中,48份(57%)呈陽性。因此,實(shí)時(shí)PCR技術(shù)是快速檢測(cè)和定量食品過敏原的重要手段。在PCR實(shí)驗(yàn)中需要設(shè)計(jì)引物,來檢測(cè)花生PCR靶基因序列,如果靶序列或引物太短,就容易出現(xiàn)假陽性,需要重新設(shè)計(jì)引物。并且實(shí)驗(yàn)過程中可能會(huì)出現(xiàn)DNA部分降解或完全降解,會(huì)導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。此外,檢測(cè)過程中還可能出現(xiàn)交叉污染。另外,Zhang等[31]采用復(fù)合引物技術(shù)設(shè)計(jì)了一個(gè)競(jìng)爭性內(nèi)擴(kuò)增控制(IAC),建立了花生過敏原Ara h 1 DNA的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法。方法的檢出限為0.005%,表明該方法對(duì)食品中花生成分的檢測(cè)具有較高的靈敏度。

目前由于使用PCR檢測(cè)花生過敏原容易出現(xiàn)假陰性和假陽性的現(xiàn)象,對(duì)于PCR技術(shù)在檢測(cè)花生過敏原的推廣還具有一定的局限性。

2.3 印跡法

印跡法(blotting)是將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上,通過特定的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品。印跡法分為免疫印跡和斑點(diǎn)印跡,一般使用斑點(diǎn)印跡和免疫印跡來檢測(cè)花生過敏原,通常將兩者結(jié)合起來共同檢測(cè)。

免疫印跡(Western blotting)又稱蛋白印跡,是一種分析蛋白質(zhì)的常用技術(shù),類似于ELISA,都屬于免疫標(biāo)記技術(shù)。利用SDS-PAGE,將蛋白質(zhì)作為被檢測(cè)物,抗體作為“探針”,用標(biāo)記的二抗“顯色”。首先通過SDS-PAGE電泳將待測(cè)蛋白分離,然后膠上的蛋白通過電場(chǎng)力的作用轉(zhuǎn)移到固相載體,兩者以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合,并且電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性保持不變。該方法具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Yapo-Crezoit等[32]采用SDS PAGE法和Western blots法兩種方法,對(duì)兩份花生種子進(jìn)行了蛋白質(zhì)圖譜分析,并結(jié)合Western blots對(duì)花生種子進(jìn)行了蛋白質(zhì)分析。在花生種子的提取物中,發(fā)現(xiàn)了致敏蛋白Ara h 1(63.5 ku)、Ara h 2(17,20 ku)和Ara h 3(25、36、40和44 ku)的可見指紋,以及Ara h 3約36 ku的致敏帶,這為花生中主要過敏原的存在提供了證據(jù)。Wu等[33]采用免疫印跡鑒定了純化的Ara h 2,其純度可以達(dá)到90%,是一種很好的檢測(cè)花生過敏原的方法。

膠體金免疫層析法以膠體金為標(biāo)記物,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的新型免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。同ELISA一樣,具有3種檢測(cè)方式。主要是將膠體金本身的顯色特點(diǎn)與免疫層析技術(shù)相結(jié)合,進(jìn)行特異性的檢測(cè)。劉悅[34]建立了一種具有高靈敏度的膠體金免疫層析試紙條。能同時(shí)檢測(cè)3種過敏原。并且檢測(cè)結(jié)果與試劑盒同步、操作簡單、用時(shí)較短并能實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)。為了提高方法的靈敏度,今后可使用單克隆抗體,并且采用上轉(zhuǎn)換材料、熒光量子點(diǎn)等新型材料作為標(biāo)記物進(jìn)行替代。

2.4 生物傳感器法

生物傳感器發(fā)展很快,種類眾多,并且逐漸應(yīng)用到食品的領(lǐng)域中,在花生過敏原蛋白的檢測(cè)中最常使用的是免疫傳感器和光傳感器。免疫傳感器是利用抗原與抗體特異性反應(yīng)而導(dǎo)致檢測(cè)裝置信號(hào)變化設(shè)計(jì)而成的一種傳感器,將傳統(tǒng)的免疫測(cè)試和生物傳感技術(shù)融為一體,具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、檢測(cè)限低、檢測(cè)速度快的特點(diǎn)。而且分析過程簡單,易于操作,測(cè)量過程自動(dòng)化。Montiel等[35]用磁免疫傳感器成功檢測(cè)了食品中的花生過敏原Ara h 2,在87～10000 pg/mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為26 pg/mL,比其它非標(biāo)蛋白有更好的選擇性。該方法成功檢測(cè)了小麥?zhǔn)称分刑砑拥幕ㄉ^敏原,檢測(cè)限低達(dá)5 mg/kg,并且能夠成功的應(yīng)用到不同的提取食物中花生過敏原的檢測(cè)。

光敏材料種類繁多,并且有較為廣泛的發(fā)展。由于適配體易于修飾和控制,不存在明顯的失活現(xiàn)象,已成為生物傳感器中分析配體的有效分子識(shí)別元件。熒光標(biāo)記適配體可用于分子識(shí)別的光學(xué)傳感器中。Weng等[36]開發(fā)了一個(gè)微流控系統(tǒng),該系統(tǒng)集成了量子點(diǎn)適配體修飾的氧化石墨烯納米生物傳感器,用于簡單、快速、靈敏的檢測(cè)食品中的過敏原。該生物傳感器利用量子點(diǎn)-適配體-氧化石墨烯配合物作為探針,在與食物過敏原相互作用時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化,通過對(duì)適配體的吸附和解吸,使氧化石墨烯的熒光猝滅和恢復(fù)性能發(fā)生熒光變化。在這種現(xiàn)成的微流控芯片中,僅用10 min就實(shí)現(xiàn)了對(duì)花生中主要過敏原Ara h 1的定量檢測(cè)。結(jié)果表明,該體系具有顯著的靈敏度和選擇性。將微流控平臺(tái)集成到自制微型光學(xué)分析儀中,為食品過敏原的快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了一種有前景的方法。并且該生物傳感器選擇相應(yīng)的適體還可用于檢測(cè)其他食物過敏原。

雖然傳感器檢測(cè)存在制作復(fù)雜、電極用于樣品檢測(cè)次數(shù)有限等不足。隨著技術(shù)水平的不斷提高,各種新型材料應(yīng)用與傳感器中能夠逐漸彌補(bǔ)這些缺陷,在未來的食品檢測(cè)中具有較大的應(yīng)用前景。

2.5 質(zhì)譜法

因?yàn)槿狈ㄉ^敏原的標(biāo)準(zhǔn)品,所以對(duì)于直接使用儀器檢測(cè)花生過敏原的文獻(xiàn)并不多。在這種情況下,利用傳統(tǒng)的儀器法建立對(duì)花生過敏原定量和定性的檢測(cè)方法非常困難。

傳統(tǒng)的應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)的方法主要有液相色譜法和毛細(xì)管電泳法。但是花生蛋白雖然種類頗多,但是理化性質(zhì)極為相似,使用上述方法進(jìn)行檢測(cè)常會(huì)出現(xiàn)基線無法分離的情況,一些極為相似的蛋白質(zhì)甚至根本無法分離。而蛋白質(zhì)中的氨基酸具有各種遺傳變異體,它們的保留時(shí)間不盡相同,在檢測(cè)過程中出現(xiàn)多重峰,導(dǎo)致檢測(cè)難度增加。由于蛋白質(zhì)在紫外檢測(cè)器280 nm的波長下都能達(dá)到最大吸收,所以經(jīng)常使用這兩種方法在該波長下進(jìn)行檢測(cè)。但是在280 nm處,基質(zhì)中的干擾物質(zhì)也能被吸收。導(dǎo)致這兩種傳統(tǒng)的方法特異性比較差,靈敏度也很差,只有5～15 μg/mL的檢測(cè)限。因此,對(duì)于食品中微量或痕量的蛋白質(zhì)的檢測(cè)來說該方法并不適用。

為了彌補(bǔ)上述不足,通常采用質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)器是根據(jù)不同蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比不同將其分離。電噴霧電離后的蛋白質(zhì)因?yàn)榱鲃?dòng)相pH、儀器等因素不同呈現(xiàn)多電荷分布。質(zhì)譜法種類頗多,不同的儀器應(yīng)用方法及特點(diǎn)都不同。目前主要采用LC-MS/MS和ICP-MS來進(jìn)行花生檢測(cè)。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)是將復(fù)雜樣品經(jīng)過液相色譜分離后,再用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)定性的技術(shù)。將兩者的分離功能和定性功能結(jié)合起來,對(duì)于復(fù)雜的混合物也可以很好地進(jìn)行定性和定量。并且簡化了樣品的前處理過程,能夠快速檢測(cè)樣品,操作也比較簡單。Daly[37]等采用質(zhì)譜法對(duì)杏仁和花生的兩種不同的ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,證明了杏仁陽性檢測(cè)結(jié)果是由于交叉反應(yīng)所致。此法成功檢測(cè)了花生蛋白,并且能夠彌補(bǔ)ELISA法交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽性的問題,表明此方法具有很好的發(fā)展前景。Shefcheck等[38]從巧克力中直接提取蛋白,經(jīng)過胰蛋白酶進(jìn)行消化,再使用LC-MS/MS定性檢測(cè),成功檢測(cè)到了花生過敏原Ara h 1,檢測(cè)限達(dá)到10 mg/kg。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)在檢測(cè)時(shí)先由氬氣將樣品引入霧化系統(tǒng)進(jìn)行霧化,然后樣品以氣溶膠形式進(jìn)入等離子體中心區(qū),在高溫和氬氣環(huán)境中樣品發(fā)生去溶劑化、汽化解離和電離,被轉(zhuǎn)化成正離子后經(jīng)離子采集系統(tǒng)進(jìn)入質(zhì)譜儀,各肽段因?yàn)橘|(zhì)荷比不同而分離,各元素含量通過元素質(zhì)譜峰強(qiáng)度來確定。Careri等[39]采用此法與LC-MS/MS法檢測(cè)Ara h 2和Ara h 3/4,檢測(cè)限分別為5、1 μg/g,并且在10～200 μg/g的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。ICP-MS與LC-MS/MS相比,ICP-MS的靈敏度相對(duì)較好,但I(xiàn)CP-MS仍有一定的局限性,還有待改進(jìn)[40]。

現(xiàn)如今,質(zhì)譜由于具有靈敏度高、分析速度快、樣品用量少、能同時(shí)進(jìn)行分離和鑒定等特點(diǎn),已經(jīng)廣泛用于檢測(cè)花生過敏原。但是由于對(duì)樣品和操作的要求比較高,儀器比較昂貴使得其應(yīng)用受到限制。

3 結(jié)論與展望

本文從蛋白質(zhì)和DNA的檢測(cè)水平綜述了多種檢測(cè)花生過敏原的方法。但是這些方法還存在著些許不足,無法達(dá)到準(zhǔn)確的定量結(jié)果。食品加工過程中經(jīng)常使用的加熱過程,會(huì)導(dǎo)致花生過敏原的一級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞,使得直接檢測(cè)花生過敏原蛋白的ELISA法和SPR法出現(xiàn)假陰性。此外可以通過加工工藝將過敏原的DNA片段從食品中完全分離出去,使得直接檢測(cè)過敏原DNA的PCR法也無法準(zhǔn)確檢測(cè)出花生過敏原。同時(shí),對(duì)于熱變性蛋白傳統(tǒng)的儀器法也無法檢測(cè),存在一定的局限性。因此,需要建立一種能直接檢測(cè)致敏蛋白和變性蛋白的方法,用于食品中的花生過敏原的定量測(cè)定。針對(duì)以上問題,就目前存在的技術(shù)來說,電化學(xué)傳感技術(shù)和液質(zhì)聯(lián)用是一個(gè)比較有發(fā)展前景的方法。而現(xiàn)如今,上轉(zhuǎn)換材料、熒光量子點(diǎn)、碳點(diǎn)等新型材料的廣泛使用也給電化學(xué)傳感器、免疫印跡等方法提供了新的研究方向。這些新型材料與目前存在的技術(shù)相結(jié)合,能夠逐漸彌補(bǔ)目前檢測(cè)方法存在的不足,為食品中花生過敏原的檢測(cè)提供了廣闊的發(fā)展前景。