宮頸脫落細胞miR34a檢測在HR-HPV陽性患者分流中的作用分析

聶小鳳 翟慧慧 冷天艷 張琴 楊麗華

摘? ?要：目的? 探討宮頸脫落細胞miR34a檢測在HR-HPV陽性患者分流中的作用。方法? 采用第二代雜交捕獲技術（HC2）進行宮頸癌初篩，HPV陽性者行TCT及miRNA檢查。TCT結果異常者（≥意義不明確的非典型鱗狀細胞）陰道鏡下活檢行病理學檢查。TCT陰性者行陰道鏡檢查，陰道鏡異常者陰道鏡下活檢取材，比較不同級別宮頸病變中miR34a水平，探討miR34a、Pap在宮頸病變中的診斷作用。結果? ①Pap對宮頸高度鱗狀上皮內病變預測值的靈敏度為64.90%，特異度為80.70%，AUC為0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001）。②miRNA34a對宮頸高度鱗狀上皮內病變預測值的靈敏度為77.00%，特異度為62.30%，AUC為0.824（95%CI：0.756～0.892，P<0.001），cut off值為0.623。③miRNA34a對宮頸高度鱗狀上皮內病變預測值的靈敏度高于Pap檢測，特異度低于Pap。④宮頸脫落細胞miRAN34a值隨著宮頸病變加重逐漸降低。結論? 檢測宮頸脫落細胞miR34a水平可有效分流HR-HPV陽性患者，敏感性高于Pap檢查。

關鍵詞：microRNA-34a;宮頸細胞學檢查;HPV;宮頸癌;篩查

中圖分類號：R737.33? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.16.012

文章編號：1006-1959（2018）16-0043-04

Analysis of the Role of MiR34a in Cervical Exfoliated Cells in Shunt of HR-HPV Positive Patients

NIE Xiao-feng，ZHAI Hui-hui，LENG Tian-yan，ZHANG Qin，YANG Li-hua

（Department of Gynecology，Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming，650101，Yunnan，China）

Abstract： Objective? To investigate the role of miR34a in cervical exfoliated cells in the shunt of HR-HPV positive patients. Methods? The second generation hybridization capture technique （HC2） was used for primary screening of cervical cancer. HPV positive patients underwent TCT and miRNA examination. Pathological examination of colposcopy biopsy was performed in patients with abnormal TCT results （≥ atypical squamous cells with unclear significance）. TCT-negative patients underwent colposcopy， colposcopy biopsy was performed， and miR34a levels were compared in different grades of cervical lesions. The diagnostic role of miR34a and Pap in cervical lesions was explored. Results? ① The sensitivity of 1Pap to the predictive value of high squamous intraepithelial lesion was 64.90%， the specificity was 80.70%， and the AUC was 0.728 （95% CI： 0.657～0.779， P<0.001）.② The sensitivity of miRNA34a for predicting cervical high-grade squamous intraepithelial lesion was 77.00%， specificity was 62.30%， AUC was 0.824 （95% CI： 0.756～0.892， P<0.001）， and cut off value was 0.623. ③The sensitivity of 3miRNA34a to the predictive value of high squamous intraepithelial lesion was higher than that of Pap， and its specificity was lower than Pap. ④ The value of miRAN34a in cervical exfoliated cells gradually decreased with the increase of cervical lesions. Conclusion? Detection of miR34a levels in cervical exfoliated cells can effectively divert HR-HPV-positive patients with higher sensitivity than Pap.

Key words：MicroRNA-34a;Cervical cytology;HPV;Cervical cancer;Screening

宮頸癌（cervical cancer）是發展中國家女性常見的惡性腫瘤，發病率逐年上升[1]。高危型人類乳頭狀瘤病毒（highrisk human papillomavirus，HR-HPV）持續感染是宮頸癌的病因，因此，HR-HPV DNA檢測成為宮頸癌篩查的方法主要之一[2]。宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）為宮頸癌癌前病變。通過篩查發現CIN，及時治療，是預防宮頸癌的有效措施。大量證據表明，HR-HPV測定較細胞學檢測在識別高級別CIN 具有更高的敏感性，但是特異性低[3-5]。2015年1月美國陰道鏡及宮頸病理學會（American society for colposcopy and cervical pathology，ASCCP）和婦科腫瘤協會（society of gynecologic oncology，SGO）更新了宮頸癌篩查指南，推薦HPV初篩可用于現代宮頸癌篩查的替代方案[6]。HPV感染是頻發事件，大多數HPV感染是一過性的，90%的HPV感染在2年內可自然消除[7，8]。因此，對HPV陽性的女性必須進行相關檢測以識別CIN，稱之為分流。細胞學檢查是首選的分流方法，但細胞學結果敏感性低，準確性依賴于讀片人員，因此尋找細胞學以外的分流方法是當前研究重點。MicroRNAs（miRNAs）是重要的基因調節因子，在多種腫瘤中異常表達。近年來有研究報道，miRNA可作為腫瘤診斷的生物標記物[9]。在宮頸癌發生中，miR-34a因為與E6蛋白作用的靶基因P53密切相關而受到關注。miR-34a是P53下游靶基因，HPV-E6蛋白靶向P53基因，P53失活導致miR-34a數量降低，調節細胞凋亡、G1期阻滯、DNA修復和凋亡的蛋白失活，因此，細胞增殖促進腫瘤的發生[10]。miR-34a水平的降低可代表HPV病毒與宿主細胞的整合，是宮頸發生病變的標識，miR-34a水平的檢測可能可作為宮頸癌篩查中HPV陽性的婦女的有效分流方法， 因此，本課題擬通過檢測HPV感染陽性患者宮頸脫落細胞miR-34a水平，與液基細胞學結果相比，比較miR-34a測定在HPV陽性患者分流中的作用，為宮頸癌篩查中HPV陽性的患者提供更敏感、客觀的分流指標提供依據。

1資料與方法

1.1一般資料? 收集2015年10月～2017年4月昆明醫科大學第二附屬醫院婦科進行宮頸癌篩查的患者30000例，年齡25～70歲，平均年齡（37.33±5.28）歲，均有性生活史，均經知情同意，進行HPV DNA檢測，HPV陽性者行TCT及miRNA檢查。TCT 結果≥意義不明確的非典型鱗狀細胞（ASCUS）者為TCT陽性，TCT陽性者直接陰道鏡下活檢行病理學檢查;TCT陰性者行陰道鏡檢查，陰道鏡異常者陰道鏡下活檢取材。

1.2 HPV檢測? 由經過培訓的婦科醫生取樣，用HPV采樣器于宮頸管內，同一方向旋轉3圈，置于樣品保存液中，4 ℃保存待檢測。采用HPV-DNA雜交捕獲Ⅱ代試驗，利用免疫學技術并通過化學發光使基因信號放大的微孔板對標本中的病毒進行微量檢測。檢測14種高危型HPV，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68。其結果以標本的相對熒光光度值（RLU）與陽性定標的域值（CO）的比值表示，RLU/CO≥1.0為陽性，相當于標本中檢出DNA負荷量≥1.0 pg/ml，反之RLU/CO<1.0 pg/ml為陰性。

1.3 TCT、miR-34a檢測? 由經過培訓的婦科醫生取樣，應用液基細胞學取樣器，于宮頸管內旋轉3～5圈，每個患者取樣2個，1個置于液基細胞的保存液中，送病理科檢查。宮頸細胞學檢測按照TBS分級系統評價標準分類：①正常范圍（WNL）;②不典型鱗狀細胞（ASCUS）;③不能排除高級別鱗狀上皮內病變不典型鱗狀上皮細胞（ASC-H）;④低級別鱗狀上皮內病變（LSIL）;⑤高級別鱗狀上皮內病變（HSIL）;⑥鱗狀細胞癌（SCC）。1個應用RT-PCR檢測宮頸脫落細胞miR-34a表達水平，收集在Trizol商品化試劑盒，Trizol法提取細胞中總RNA，按照miR檢測試劑盒說明，應用RT-PCR法測量miR-34a表達。

1.4組織學診斷? TCT檢查異常者90例，TCT正常，陰道鏡檢查異常者202例，共292例患者在陰道鏡下進行活檢。根據2014年第四版WHO女性生殖器官腫瘤分類將疾病分為兩個級別：低度鱗狀上皮內病變（LSIL）和高度鱗狀上皮內病變（HSIL）[11]。

1.5統計學處理? 采用SPSS22.0軟件包進行統計學分析。ROC曲線用于分析Pap、miR-34a檢測在高級別宮頸上皮內瘤變診斷中的價值，根據最大約登指數確定Pap、miR-34a的cut off值，比較TCT、miR-34a診斷HSIL的敏感性、特異性，評價宮頸脫落細胞miR-34a檢測在HR-HPV陽性患者的分流作用。所有統計學分析均采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.001表示統計學意義極顯著。

2結果

2.1研究對象基本信息? 30000例女性參加HPV檢測的初篩，其中1140例HPV陽性。450例女性因不愿繼續檢測，690例繼續篩查，行Pap、miRNA檢測，95例女性因為取出標本細胞過少無法行miRNA檢測，僅行Pap檢測，595例女性完成了Pap檢測和miRNA檢測。其中90例女性Pap結果異常，直接陰道鏡下活檢。505例Pap結果未見異常行陰道鏡檢查，陰道鏡檢查結果正常303例，陰道鏡結果異常202例，陰道鏡異常者行宮頸活檢，共292例行陰道鏡下活檢。292例宮頸活檢組織學結果：正常189例，LSIL 29例，HSIL 71例，CC 3例。

2.2不同級別宮頸病變宮頸脫落細胞miRNA34a水平? RT-PCR檢測宮頸脫落細胞miR-34a表達水平，發現隨著宮頸病變程度的增加，miRNA34a的表達水平逐漸下降，miR-34a表達值在正常組、LSIL組、HSIL組及CC組分別為（0.74±0.07）×10-3、（0.61±0.06）×10-3、（0.52±0.08）×10-3、（0.35±0.09）×10-3，且與正常組及LSIL組相比，HSIL組及CC組均較低，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 Pap結果與宮頸病變的關系? 292例（Pap陰性202例，Pap陽性90例）進行宮頸活檢，組織學結果顯示：正常組189例，其中Pap陰性161例，Pap陽性28例;LSIL組29例，其中Pap陰性15例，Pap陽性14例;HSIL組71例，其中Pap陰性26例，Pap陽性45例;CC組3例，其中Pap陰性0例，Pap陽性3例。

2.4 Pap對HSIL的預測作用? Pap對診斷HSIL的預測值的靈敏度為64.90%，特異度為80.70%，AUC為0.728（95%CI：0.657～0.779，P<0.001），見圖1。

圖1? ?Pap診斷HSIL的ROC曲線

2.5 miRNA34a對HSIL的預測作用? miRNA34a對診斷HSIL的預測的靈敏度為77.00%，特異度為62.30%，AUC為0.824（95%CI：0.756～0.892，P<0.001），cut off值為0.623，見圖2。

圖2? ?miRNA34a診斷HSIL的ROC曲線

3討論

2015年1月美國陰道鏡及宮頸病理學會（ASCCP）和婦科腫瘤協會（SGO）更新了宮頸癌篩查指南，推薦HPV初篩可用于現代宮頸癌篩查的替代方案，HPV檢測敏感性高，能夠最大限度地篩查出疾病。但是HPV感染率較高，絕大多數感染是一過性的，90%的感染在2年內清除，也就是說大多數婦女感染HPV后可以自行清除病毒，僅有部分患者持續感染，持續感染的婦女中也僅有部分患者發生CIN或宮頸癌[7，8]。因此，HR-HPV初篩陽性婦女必須分流，HPV檢測的目的不是明確是否有HR-HPV感染，而是預測是否存在高級別CIN，避免處理一過性HPV感染及其相關的良性病變。目前，細胞學檢查是首選的分流方法[12]，細胞學篩查的特異性較高，可達到90%以上，但其敏感性只有42%～73%[13，14]。我國宮頸癌的篩查起步較歐美等西方發達國家晚，由于經濟發展和技術力量的不均衡，很難有一個全國統一的篩查策略，國內的醫生大多數采用或借鑒國外的篩查經驗。現階段國內尚缺乏針對宮頸癌篩查策略的大樣本多中心的隨機研究，對于HPV感染的型別分布各個研究中心也不統一。另外，我國缺乏經歷正規培訓的有經驗的細胞學病理專家，細胞學分流的作用受到更大的挑戰。加上我國目前特殊的醫療環境、敏感的醫患關系，為避免HPV陽性的婦女漏診可能存在的CIN，臨床醫生可能會更多的推薦陰道鏡檢查甚至是宮頸活檢以明確診斷。對HPV陽性的婦女采用抗病毒、免疫治療等“更積極”“更迎合”患者恐癌、懼癌，要求治療的心態，以避免因為目前分流措施不完善可能導致的漏診。因此，我們更需要探討簡便、敏感性強、特異性高的HPV陽性患者的分流方法。

微RNA（microR-NA，miRNA）是一類內源性的非編碼單鏈小分子RNA，長度約為18～25個核苷酸，可與靶信使RNA（mRNA）3'端非翻譯區（3'-UTR）互補配對結合，進而引起靶mRNA降解或翻譯抑制，調控基因表達。根據生物信息學推測，大約30%以上的人類基因受到miRNA的調控[15]。現有研究表明，HPV表達的致癌蛋白E6、E7和E5直接或間接導致了多種mi-RNAs，如miR-34a、miR-218、miR-29a及miR-146a 等表達改變，進而導致宮頸癌的發生發展，而少數mi-RNAs如miR-203及miR-125b等還參與了HPV病毒DNA的復制[16，17]。

miR-34a家族因為其與HPV蛋白之間可能的反應，在HPV感染、宮頸癌發生、發展中的作用被研究。miR-34家族包括3種同源基因，分別是miRNA-34a、miRNA-34b、miRNA-3c。其中miRNA-34a位于1p36.23，含有兩個外顯子，兩個外顯子之間間隔約30kb的內含子，編碼成熟miRNA-34a的序列位于第二外顯子。miRNA-34a可通過靶定多種周期及凋亡相關蛋白（如CyclinE2、CDK4、C-myc和Bcl-2等）mRNA的3′UTR區而在轉錄后水平上對基因的表達進行負調控，使這些蛋白的mRNA降解，使細胞周期不向S期轉換，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，從而抑制腫瘤的發生[18]。反之，如果miR-34a表達降低，將會導致細胞增殖失控，凋亡抑制，最終形成腫瘤。近來有研究發現P53直接轉錄miR-34家族的表達，是P53腫瘤抑制蛋白的直接靶標，在宮頸癌發生中，HPV感染宮頸細胞中，HPV對宿主細胞產生免疫攻擊，這種免疫攻擊主要是通過HPV基因組整合到宿主細胞，基因組整合后HPV-E6蛋白表達，HPV-E6蛋白靶向P53基因，通過泛素蛋白酶途徑降解P53，導致P53有效性降低，P53失活導致可與miR-34結合位點的啟動區域的蛋白數量的減少，從而下調大多數被HPV感染的組織中miR-34的表達，導致miR-34a數量降低，因此導致細胞凋亡、G1期阻滯、DNA修復和凋亡的蛋白失活，因此細胞增殖，促進腫瘤的發生。有研究報道，miR-34a表達從宮頸上皮內瘤變到宮頸癌逐漸下調，低的miR-34a水平可能與病毒的整合、E6蛋白的表達及P53缺失有關[19]。

本研究發現，宮頸脫落細胞中，miRNA34a在宮頸癌和高級別宮頸上皮內病變中的表達水平顯著低于它們在正常宮頸及低級別宮頸上皮內病變中的表達，且miRAN34a值隨著宮頸病變加重逐漸降低，同時在HSIL預測中也能發揮一定的作用。在對HSIL預測中，miRAN34a與Pap相比較，miRAN34a診斷宮頸病變的敏感性，AUC顯著高于Pap。提示miRAN34a檢測作為生物標記物用于宮頸癌篩查中HPV陽性的婦女的有效分流的潛在臨床價值，值得進一步研究。

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收稿日期：2018-6-1;修回日期：2018-6-10

編輯/楊倩