1—MCP對采后金桔青霉病的誘導抗性作用研究

劉春帥 高立陽 鄭慧 金童 張曉敏 朱潔 孟亞欣 宋靜 傅茂潤 楊曉穎

摘要：本試驗以金桔為材料，研究1-甲基環丙烯（1-MCP）對金桔采后青霉病的控制效果以及對金桔生理生化指標的影響，從而探究1-MCP對采后金桔青霉病的影響機理。研究表明：用1 mg/L的1-MCP處理金桔較對照可以顯著抑制青霉病菌的生長，減小病斑直徑。同時1-MCP處理能抑制金桔的呼吸強度，從而延緩果實衰老。1-MCP可以通過降低多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）活性、提高超氧化物歧化酶（SOD）活性、降低總酚含量提高金桔對青霉病的抗性。

關鍵詞：1-MCP；誘導抗性；青霉病；金桔

中圖分類號：S666.9 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）09-0109-06

Abstract The experiment was conducted to study the effect of 1-MCP on controlling penicilliosis and physiological and biochemical indexes of postharvest kumquat，and also exploring the mechanism of 1-MCP on penicilliosis. The results showed that 1 mg/L 1-MCP could significantly inhibit the growth of Penicillium and decrease the diameter of disease spots compared with control. At the same time， 1-MCP treatment could inhibite the respiration intensity of kumquat. The induced resistance of 1-MCP on penicilliosis was enhanced by inhibiting the activity of PPO and POD， inducing the activity of SOD， and reducing the total phenol content in kumquat.

Keywords 1-Methylcyclopropene； Induced resistance； Penicilliosis；Kumquat

金桔是一種在我國廣泛種植的經濟作物，年平均產量約28×104 t。金桔采摘后很容易腐爛變質，常溫條件下貨架期較短，每年果農因未能及時運輸所致果實腐爛造成不小的經濟損失。

近年來，國內對金桔的貯藏保鮮已有研究。陳浩等[1]研究表明輻照降解殼聚糖處理可顯著降低金桔失重率和腐爛率，延緩總酸、可溶性固形物以及抗壞血酸含量的下降，延長貯存期達18 d，并保持其營養品質。黎繼烈等[2]研究表明，臭氧可以明顯抑制金桔的呼吸強度，延緩果實硬度的下降，增強SOD活性，減少丙二醛（MDA）的積累，同時提高金桔的抗病性，有效延緩果實的成熟衰老。然而這些研究仍無法滿足當今市場的需求，因此研究金桔的保鮮和誘導抗性具有重要的經濟意義。

1-MCP是一種新型乙烯抑制劑，具有經濟、低量、無毒、綠色環保、使用方便等優點。有關1-MCP在果蔬、花卉采后保鮮及誘導抗性等方面的作用已經逐漸被學者關注。在花卉上，Serek等[3]研究發現1-MCP對延長花期、提高花卉的保鮮效果有良好的作用。在果蔬方面，1-MCP已被逐步應用于碭山酥梨[4]、草莓[5]、鮮棗[6]等水果的保鮮并具有良好的效果。1-MCP通過競爭性抑制乙烯與受體的結合，導致乙烯信號傳導受阻，從而達到延緩成熟的目的[7]。金桔屬非躍變型水果，1-MCP對金桔采后誘導抗性方面的研究尚未見報道。本試驗目的是研究1-MCP對金桔采后青霉病的控制效果以及對金桔生理生化指標的影響，探索其在金桔采后貯藏保鮮領域的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金桔：挑選大小均勻、無病蟲害、無機械傷、色澤及成熟度一致的果實為試材。采摘后當天運回實驗室。

試劑：1-MCP、氫氧化鈉、草酸、次氯酸鈉、無水乙醇、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰苯二酚、愈創木酚、30%過氧化氫、甲硫氨酸、NBT、EDTA-Na2、核黃素、三氯乙酸，均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

超聲波清洗儀、可見光分光光度計、冷凍離心機、培養箱、高壓滅菌鍋（LDZF系列，上海申安醫療器械廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 金桔果實的處理 選取400枚金桔用0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min（除去金桔表面病原菌），清水沖洗干凈，果筐中晾干后進行以下處理：將金桔置于0.03 mm厚的聚乙烯保鮮袋內，袋中放置一袋用水浸濕的1-MCP藥袋，使袋內1-MCP的最終濃度為1 mg/L，放于25℃恒溫箱中貯藏，以不放1-MCP藥袋為對照（CK）。每個處理設置3個平行，每個平行60枚金桔，每隔2 d觀察腐爛程度并測定理化指標，共觀察30 d。

1.3.2 測定指標 記錄金桔果實的腐爛數量，并利用以下公式計算腐爛率：

腐爛率（%）=腐爛金桔個數/金桔總個數×100。

病斑直徑：借助血細胞計數器調整指狀青霉菌懸液濃度為1 × 104 cfu/mL，使用無菌鐵釘刺入金桔約一個釘頭深淺，用移液器吸取20 μL菌懸液進行接種。接種部位朝上置于恒溫箱內培養3 d，十字交叉法測量病斑直徑。

呼吸強度：采用靜置法測定金桔呼吸強度。培養皿中倒入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液20 mL，平穩放置在干燥器底部。干燥器中放置24枚金桔，密封后，靜置1 h。之后將培養皿中氫氧化鈉溶液移入錐形瓶中。滴入兩滴酚酞溶液，用0.2 mol/L草酸滴定直至溶液透明無色，靜置30 s不變色，記錄使用的草酸含量。

總酚含量：稱取1 g果實樣品，研磨成勻漿后用70%乙醇溶液洗脫，采用福林酚法[8]測定，結果以沒食子酸的含量來表示。

PPO活性：稱取2 g果實樣品，研磨成勻漿后用5 mL 0.05 mol/L、pH 6.5磷酸緩沖液洗脫，采用鄰苯二酚法測定[9]，1個活力單位（U）定義為在測定條件下1 min引起吸光值改變0.01所需的酶量。

POD活性：稱取2 g果實樣品，研磨成勻漿后用5 mL 0.1 mol/L、pH 6.0磷酸緩沖液洗脫，使用分光光度法測定[10]，1個活力單位（U）定義為在測定條件下1 min引起吸光值改變0.01所需的酶量。

SOD活性：稱取1.5 g果實樣品，研磨成勻漿后用7.5 mL 0.05 mol/L、pH 7.8磷酸緩沖液洗脫，使用分光光度法測定[11]，1個活力單位（U）定義為引起四唑氮藍（NBT）光還原的相對抑制率為50%時所需要的酶量。

2 結果與分析

2.1 腐爛率

經過30 d的觀察與記錄發現，1-MCP處理組腐爛率為4.2%，對照組腐爛率為27.1%（圖1）。對照組腐爛率遠高于1-MCP處理組，說明1-MCP可以有效抑制金桔果實的腐爛。

2.2 病斑直徑

損傷接種指狀青霉3 d后，1-MCP處理組與對照組相比，病斑面積小，發病率低。1-MCP處理組發病金桔平均病斑直徑為0.2 cm，而對照組發病金桔平均病斑直徑為1.1 cm（圖2）。因此可以得出，1-MCP可以有效控制金桔指狀青霉的病斑擴散。

2.3 呼吸強度

由圖3可知，兩組的呼吸強度都是先下降后上升，前4 d 1-MCP處理組呼吸強度弱于對照組，且在第2 d呼吸強度最低，接近對照組的二分之一，表明經1-MCP處理后的金桔在一段時間內呼吸強度弱于對照組，1-MCP對呼吸強度的抑制效果隨時間延長而降低。

2.4 總酚

由圖4可以看出，對照組金桔總酚含量在貯藏期間的變化趨勢是先上升后下降，1-MCP處理則呈先降低后升高之后又降低的變化趨勢。在采后貯藏的2～4 d內，1-MCP處理組與對照組總酚含量相差較大，隨后兩組的總酚含量逐漸接近，但1-MCP處理組的總酚含量始終低于對照組，說明1-MCP可以降低金桔中總酚含量。

2.5 多酚氧化酶

由圖5A可以看出，采后金桔的PPO活性先下降后上升。1-MCP處理過的金桔PPO活性下降更快，與對照組都在第4 d達到最低值，且1-MCP處理組PPO活性比對照組更低。說明1-MCP可抑制PPO活性。

2.6 過氧化物酶

由圖5B可以看出，金桔貯藏期內POD活性先上升后下降，4 d后金桔POD活性急劇降低，6 d后近乎為零，說明采后金桔POD活性維持時間不長。1-MCP處理組POD活性一直低于對照組，說明1-MCP能抑制POD活性。

2.7 超氧化物歧化酶

由圖5C可以看出，1-MCP處理組與對照組的SOD活性都是先上升后下降，在第4 d達到峰值，且1-MCP處理組峰值較對照組高。試驗時間內1-MCP處理組SOD活性一直高于對照組，下降速度慢于對照組。說明1-MCP可以提高SOD活性，延緩酶活下降速度。

3 討論與結論

1-MCP對果蔬的影響主要表現在抑制植物乙烯釋放量、延緩果蔬衰老和誘導果蔬提高對采后病害的抗病能力上。關于1-MCP延緩果蔬成熟衰老等方面已得到廣泛研究[7]。而1-MCP對抗病功能的誘導以及植物最終的抗病表現主要因病害種類、1-MCP濃度的不同而不同[12]。駢躍斌等[13]研究表明，1-MCP對香菇的保鮮作用表現在0.9 mg/L濃度條件下能夠有效抑制子實體的呼吸作用和褐變，延長保鮮時間，改善貯藏品質。Xu等[14]研究表明，1-MCP處理可以破壞炭疽病菌的孢子膜，顯著抑制芒果果實炭疽病的發生。Li 等[15]研究表明，用濃度為5 μL/L的1-MCP處理可有效抑制蘋果青霉病。周曉婉等[16]用1 μL/L的 1-MCP 處理蘋果，較對照可顯著降低蘋果灰霉病的發病率，抑制病斑的擴展。Saftner等[17]研究發現，1-MCP處理可以減輕蘋果受青霉、灰霉以及炭疽菌病害的影響。Jiang等[18]研究表明，“珠穆朗瑪峰”草莓的主要病害是由匍枝根霉引起的果實腐爛，用1-MCP處理可以降低病害的發生。本試驗表明，1-MCP能夠有效控制采后金桔青霉病的生長，明顯降低果實的發病率，抑制病斑直徑的增大。這與上述研究及1-MCP處理防治桃[19]、棗[20]等果實采后病害的研究結果相似，說明1-MCP可以誘導部分植物抗性增強。

PPO是一類廣泛分布于植物體內的由核基因編碼、多基因控制的一種銅結合酶，參與生物氧化，對植物的抗病性、農產品的品質有重要的影響[21]。酚類是植物的次生代謝產物，其合成途徑主要是通過苯丙烷類代謝途徑，在對組織防御、果實衰老等方面有影響[22]。李保聚等[23]研究表明，黃瓜接種黑星病菌后，抗病品種葉組織中PPO活性迅速提高，明顯高于對照和感病品種。石雪暉等[24]試驗表明，在葡萄黑痘病暴發盛期，正常葉中的 PPO活性比病葉高，且PPO增加的比例與抗病性呈正相關。PPO還可以引起果蔬酶促褐變，果實的酶促褐變與多酚氧化酶活性密切相關。當果蔬外表皮受損時，PPO與底物的亞細胞區域化被打破，PPO底物被激活，產生黑色或褐色的沉積物，引起褐變[25]。本試驗表明，1-MCP處理后，金桔的PPO活性和總酚含量與對照組相比明顯下降，說明1-MCP抑制PPO的活性，對常溫放置的金桔在延緩衰老等方面有影響。但試驗后期，1-MCP處理組的PPO活性與對照組相比有上升的趨勢，這可能與果蔬的品種有關，對于金桔PPO活性的表達還應繼續探究。

過氧化物酶（POD）存在于植物、動物和微生物，是生物體中一類末端氧化酶和過氧化氫清除酶類。它與植物衰老及抗逆性都有密切關系[26，27]。POD可在生物抗病或衰老初期表達，表現為防御效應。POD也可在衰老后期表達，參與活性氧的生成，是植物體衰老到一定階段的產物，可作為衰老指標[28]。劉紅霞等[29]研究表明，1-MCP熏蒸處理桃果實后，PPO和POD的活性上升，誘導桃果實對青霉菌產生抗性，減少青霉病的發生。本試驗表明，1-MCP處理后金桔的POD活性與對照組相比略有下降，說明1-MCP可影響 POD活性，但不是主要因素。這與Li等[30]認為1-MCP 能夠顯著促進富士蘋果POD活性、延緩果實衰老、提高抗病性不同，這可能與1-MCP處理效應在不同果蔬品種上所表現的差異有關。

SOD是一種抗氧化酶。植物正常代謝過程和遭受脅迫時均能產生活性氧和自由基，活性氧和自由基的積累引起細胞結構和功能的破壞。SOD可以清除活性氧自由基，從而減少自由基對膜的損傷，達到延緩細胞衰老的目的[31]。SOD歧化超氧物陰離子自由基生成H2O2和分子氧，在保護細胞免受氧化損傷過程中具有十分重要的作用[32]。付永琦等[33]發現1-MCP能明顯提高獼猴桃采后SOD活性，并推遲SOD活性峰值的出現。蘇新國等[34]研究表明，1-MCP 處理菜用大豆可以保持較高的SOD和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性。在肥城桃上的研究表明，1-MCP可提高果實POD、SOD活性，延緩果實的衰老[35]。本試驗表明，1-MCP處理與對照組相比，能明顯提高SOD活性，可有效保護金桔免受活性氧的傷害，穩定生物膜結構，延緩金桔衰老，提高金桔抗性。

1 mg/L的1-MCP氣體對金桔進行熏蒸處理，可以有效降低金桔常溫放置條件下的腐爛率，控制金桔采后青霉病的發生。接種指狀青霉的試驗也同樣證明了1-MCP可以有效抑制病斑的生長。與對照組相比，1-MCP處理減少了果實的總酚含量，抑制了PPO與POD活性，提高了SOD活性。通過改變酶的活性，進而引起金桔蛋白變化，從而延緩果實衰老，誘導抗性。因此可以推測1-MCP對于抑制金桔的成熟與腐爛、預防青霉病、誘導金桔的抗病性、延長果實的保鮮期有著良好的應用前景。

參 考 文 獻：

[1] 陳浩， 高鵬， 高雅， 等. 輻照降解殼聚糖涂膜對沙糖桔、圣女果和金桔的保鮮作用[J]. 核農學報，2008，22（5）：640-644.

[2] 黎繼烈， 彭湘蓮， 鐘海雁， 等. 臭氧保鮮處理對金橘采后生理的影響[J]. 中國食品學報， 2007，7（3）：112-115.

[3] Serek M， Sisler E C， Reid M S. Novel gaseous ethylene binding inhibitor prevents ethylene effects in potted flowering plants[J].J. Am. Soc. Hortic. Sci.， 1994， 119（6）： 1230-1233.

[4] 孫希生， 王文輝， 李志強， 等. 1-MCP對碭山酥梨保鮮效果的影響[J]. 保鮮與加工， 2001， 1（7）： 14-16.

[5] Ku V V V， Wills R B H， Ben-Yehoshua S. 1-Methylcyclopropene can differentially affect the postharvest life of strawberries exposed to ethylene[J]. HortScience， 1999， 34（1）：119-120.

[6] 王文輝， 王志華， 李志強， 等. 1-MCP對鮮棗采后生理及保鮮效果的影響[J]. 保鮮與加工， 2003， 3（1）： 21-23.

[7] 王文輝， 孫希生， 李志強， 等. 1-MCP對水果采后生理及保鮮效果的影響[C]//中國園藝學會第九屆學術年會論文集. 北京： 中國科學技術出版社， 2001： 106-110.

[8] 李巨秀， 王柏玉. 福林-酚比色法測定桑椹中總多酚[J]. 食品科學， 2009， 30（18）： 292-295.

[9] 曹建康， 姜微波， 趙玉梅. 果蔬采后生理生化實驗指導[M]. 北京： 中國輕工業出版社， 2007： 126-127.

[10] 湯紹虎， 羅充. 植物生理學實驗教程[M]. 重慶： 西南師范大學出版社， 2012： 126-127.

[11] 李合生. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000： 164-165.

[12] 董漢松. 植物誘導抗病性原理和研究[M]. 北京： 科學出版社， 1995： 97-99.

[13] 駢躍斌， 劉晶， 車星星， 等. 1-MCP對香菇采后生理及其保鮮效果的影響[J]. 山西農業科學， 2013， 41（7）： 745-748.

[14] Xu X， Lei H， Ma X， et al. Antifungal activity of 1-methylcyclopropene （1-MCP） against anthracnose （Colletotrichum gloeosporioides） in postharvest mango fruit and its possible mechanisms of action[J]. Int. J. Food Microbiol.， 2016， 241：1-6.

[15] Li J， Lei H， Song H， et al. 1-Methylcyclopropene （1-MCP） suppressed postharvest blue mold of apple fruit by inhibiting the growth of Penicillium expansum[J]. Postharvest Biol. Tec.， 2017， 125： 59-64.

[16] 周曉婉， 唐永萍， 石亞莉， 等. 1-MCP 對低溫貯藏蘋果灰霉病抗性的誘導作用[J]. 食品科學， 2016， 37（12）：254-260.

[17] Saftner R A， Abbott J A， Conway W S， et al. Effects of 1-methylcyclopropene and heat treatments on ripening and postharvest decay in golden delicious apples[J]. J. Am. Soc. Hortic. Sci.， 2003， 128（1）：120-127.

[18] Jiang Y， Joyce D C， Terry L A. 1-Methylcyclopropene treatment affects strawberry fruit decay[J]. Postharvest Biol. Tec.， 2001， 23（3）：227-232.

[19] Liu H X， Jiang W B， Zhou L G， et al. The effects of 1-methylcyclopropene on peach fruit （Prunus persica L. cv. Jiubao） ripening and disease resistance[J]. Int. J. Food Sci. Tech.， 2005， 40（1）：1-7.

[20] Zhang Z，Tian S，Zhu Z，et al. Effects of 1-methylcyclopropene （1-MCP） on ripening and resistance of jujube（Zizyphus jujuba cv. Huping）fruit against postharvest disease[J].LWT-Food Sci. Technol.， 2012， 45（1）： 13-19.

[21] 代麗， 宮長榮， 史霖， 等. 植物多酚氧化酶研究綜述[J]. 中國農學通報， 2007， 23（6）： 312-316.

[22] Albert N W， Lewis D H， Zhang H， et al. Light-induced vegetative anthocyanin pigmentation in Petunia[J]. J. Exp. Bot.， 2009， 60（7）： 2191-2202.

[23] 李保聚， 李鳳云. 黃瓜不同抗性品種感染黑星病菌后過氧化物酶和多酚氧化酶的變化[J]. 中國農業科學， 1998， 31（1）： 86-88.

[24] 石雪暉， 王淑英， 吳艷純， 等. 葡萄葉片中單寧、木質素、PPO 活性與抗黑痘病的關系[J]. 葡萄栽培與釀酒， 1997（4）： 8-11.

[25] 陳桂信， 潘東明， 賴鐘雄， 等. 園藝植物多酚氧化酶的分子生物學研究進展[J]. 江西農業大學學報， 2003， 25（1）： 107-110.

[26] 王晶英， 趙雨森， 王臻， 等. 干旱脅迫對銀中楊生理生化特性的影響[J]. 水土保持學報， 2006， 20（1）： 197-200.

[27] 繳麗莉， 倪志云， 路丙社， 等. 低溫脅迫對青榨槭幼樹抗寒指標的影響[J]. 河北農業大學學報， 2006， 29（4）：44-47.

[28] 張蜀寧， 張振超， 張紅亮， 等. 低溫脅迫對不同倍性不結球白菜生長及生理生化特征的影響[J]. 西北植物學報， 2008， 28（1）： 109-112.

[29] 劉紅霞， 姜微波， 羅云波， 等. 1-MCP及乙烯處理對損傷接種桃果實Penicillium expansum的抑制[J]. 食品工業科技， 2003， 24（z1）： 152-156.

[30] Li F J， Zhai H， Yang H Q， et al.Effects of 1-MCP on ethylene synthesis and metabolism of apple during storage[J]. Agr. Sci. China， 2003， 2（11）： 1259-1265.

[31] 陳金印， 劉康. 1-MCP處理對秋番茄果實采后生理及貯藏效果的影響[J]. 食品科學， 2008， 29（10）： 598-603.

[32] 馬旭俊， 朱大海. 植物超氧化物歧化酶（SOD）的研究進展[J]. 遺傳， 2003， 25（2）： 225-231.

[33] 付永琦， 陳明， 劉康， 等. 1-MCP 二次處理對獼猴桃果實采后生理生化及貯藏效果的影響[J]. 果樹學報， 2007， 24（1）： 43-48.

[34] 蘇新國， 鄭永華， 張蘭， 等. 菜用大豆采后用不同濃度1-MCP處理對貯藏期間衰老及腐爛的影響[J]. 中國農業科學， 2003， 36（3）： 318-323.

[35] 李富軍， 翟衡， 楊洪強， 等. 1-MCP和 AVG 對肥城桃果實采后衰老的影響[J]. 果樹學報， 2004， 21（3）： 272-274.