防治藍莓棒狀擬盤多毛孢菌化學藥劑的室內篩選

薛德勝 邵兆浩 李保華 王彩霞

摘要：為明確山東省藍莓葉斑病和根腐病病原菌種類并篩選有效防治藥劑，采用組織分離法獲得菌株，通過形態學和分子生物學技術，結合柯赫氏法則對菌株進行鑒定，同時測試了8種藥劑對病原菌生長及6種藥劑對分生孢子萌發的影響。結果顯示，引起山東省藍莓葉斑病和根腐病的病原菌均為棒狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）；苯醚甲環唑和福美雙對P. clavispora菌絲生長的抑制效果最好，EC50均為1.97 mg/L，其次為苯甲·丙環唑，EC50為2.70 mg/L；福美雙對分生孢子萌發的抑制效果最顯著，EC50為0.004 mg/L，其次為苯醚甲環唑和戊唑醇；甲基硫菌靈對該菌幾乎沒有抑制作用。

關鍵詞：棒狀擬盤多毛孢；藍莓；殺菌劑；抑菌效果

中圖分類號：S436.639 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）09-0115-04

Abstract In order to clarify the pathogens and screen out the effective fungicides for blueberry leaf spot and root rot diseases in Shandong Province， the strains were obtained using tissue isolation method and identified based on morphological， molecular biology techniques and Koch s Rule. The inhibitory effects of 8 kinds of fungicides on mycelia growth and 6 kinds of fungicides on spore germination were determined. The results showed that the pathogen of blueberry leaf spot and root rot diseases in Shandong Province was Pestalotiopsis clavispora. Difenoconazole and thiram had the best inhibition on mycelia growth，and both the EC50 were 1.97 mg/L， followed by difenoconazole·propiconazole with the EC50 as 2.70 mg/L. The thiram had the best inhibition on conidia germination and the EC50 was 0.004 mg/L， followed by difenoconazole and tebuconazole. However， thiophanate-methyl had almost no inhibition effects on the pathogen.

Keywords Pestalotiopsis clavispora； Blueberry； Fungicides； Inhibitory effect

藍莓（Vaccinium spp.）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生小灌木漿果類果樹，具有很好的營養保健作用[1]，1983年引入我國并進行栽培研究[2]。山東半島地區因氣候和土壤適合藍莓生長，青島膠南、威海乳山、日照五蓮等地先后建立藍莓生產基地，促進了山東半島地區藍莓產業的快速發展[3]。近年來，隨著我國藍莓栽培面積的不斷擴大，病害也隨之傳播蔓延并逐年加重，成為制約藍莓產業健康發展的主要限制因素[4-6]。

2016年和2017年8—9月，山東半島藍莓種植基地苗圃內葉斑病和根腐病大發生，造成大量苗木死亡。為明確藍莓兩種病害的病原菌種類及不同藥劑對病原菌室內抑菌效果，本研究通過形態學和分子生物學技術確定病原菌種類，并通過菌絲生長速率法和孢子萌發法對多種殺菌劑進行室內篩選，以期為藍莓葉斑病和根腐病有效防控提供參考依據。1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病樣及植物：2016年和2017年8—9月在山東半島藍莓種植基地采集發病藍莓植株，帶回實驗室進行病原菌分離。供試藍莓品種為公爵（cv. Duke）。

供試藥劑：根據生產上常用殺菌劑，選取其中8種為供試藥劑（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 藍莓葉斑病和根腐病病原菌鑒定 從發病藍莓葉片和根部取樣，采用組織分離法進行病原菌的分離和純化，分別獲得3個菌株，保存于青島農業大學果樹病害流行與綜合防控實驗室。25℃恒溫暗培養，定期觀察菌落生長情況及產孢特征，根據形態學初步鑒定病菌。提取真菌基因組DNA[7]，利用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。PCR反應體系（25 μL）：2 × TSINGKE Master Mix 12.5 μL，ITS1/ITS4（10 μmol/L）各1 μL，DNA 1 μL，超純水補至25 μL。PCR反應條件：94℃ 3 min；94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 40 s，共35個循環；72℃ 10 min。經凝膠電泳檢測后，交由青島擎科梓熙生物技術有限公司進行測序，將獲得的序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析并對病原菌進行鑒定。最后根據科赫氏法則回接健康藍莓葉片和根部驗證病原的致病性。

1.2.2 菌絲生長抑制試驗 采用生長速率法[8]，測試8種殺菌劑對病菌的毒力。在無菌條件下，用無菌水將8種殺菌劑分別配成不同濃度梯度的藥液，將49 mL PDA融化并冷卻至45℃左右，每瓶PDA加入1 mL藥液，充分搖勻，制成最終濃度（表1）的含藥PDA，等量倒入直徑為5.5 cm 的培養皿中，用5 mm打孔器在活化好的菌落邊緣打取菌餅，接種于含不同藥劑濃度PDA平板中央，置于25℃恒溫暗培養，以不含藥劑的無菌水處理作空白對照，每處理重復3次。3 d后用十字交叉法測量菌落直徑，計算毒力回歸方程。

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑） × 100 。

1.2.3 孢子萌發抑制試驗 通過孢子萌發試驗[8]，測試6種殺菌劑對分生孢子萌發的影響。配置分生孢子懸浮液濃度至1.0×106個/mL，分別吸取孢子懸浮液和表1中不同濃度殺菌劑溶液的兩倍液各50 μL，滴于潔凈的單凹載玻片上，置于25℃恒溫培養箱中培養，以無菌水為對照，每處理重復3次。12 h后在顯微鏡下觀察，統計各處理三個視野中的分生孢子萌發率，并計算毒力回歸方程。

孢子萌發率（%）=萌發孢子量/總孢子量×100 ；

孢子萌發抑制率（%）=（1-處理孢子萌發率）/對照孢子萌發率×100 。

2 結果與分析

2.1 藍莓葉斑病和根腐病病原菌鑒定

從典型癥狀的藍莓病葉和病根上通過組織分離法分別獲得3個菌株，菌落均為圓形，呈白色絨毛狀，菌落正面未有明顯色素產生，背面呈淡黃色；培養3 d 時，菌落上開始形成黑色分生孢子盤，隨后溢出分生孢子角，培養7 d時，可見大量的分生孢子盤和分生孢子角；成熟分生孢子呈紡錘形，由5個細胞組成，頂端具有2 ～ 4根透明附屬絲，基部1根附屬絲，3個中間細胞為橄欖色，比末端細胞顏色深。根據菌落和分生孢子形態特征，初步鑒定該病原菌為棒狀擬盤多毛孢菌。通過對菌株ITS序列進行PCR擴增和凝膠電泳檢測，均獲得約600 bp的目標片段（圖1）。純化PCR后分別進行測序，序列分析結果顯示兩種病菌菌株的ITS序列完全一致，說明為同一種真菌，在NCBI數據庫進行BLAST同源性比對，與不同來源棒狀擬盤多毛孢的同源性均在99%以上。結合形態學鑒定結果，將藍莓葉斑病和根腐病病原菌鑒定為棒狀擬盤多毛孢。將菌株回接后，兩者均發病，且發病癥狀與田間一致，后期產生分生孢子盤和分生孢子，再次組織分離和進行挑單孢，均獲得相同菌株。

2.2 化學藥劑篩選

8種化學藥劑對病原菌均有不同程度的抑制作用，且隨藥劑濃度升高抑制作用逐漸增強（圖2）。表2結果顯示，三唑類殺菌劑苯醚甲環唑和有機硫類殺菌劑福美雙對病原菌的抑制效果最明顯，EC50均為1.97 mg/L；其次為三唑類殺菌劑苯甲·丙環唑和二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲，EC50分別為2.70 mg/L和5.63 mg/L；抑菌效果最差的為苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈，其EC50高達334 146.81 mg/L。

2.3 孢子萌發試驗

6種殺菌劑對孢子萌發均有一定的抑制效果，且隨著濃度增加分生孢子萌發率降低。表3結果顯示，有機硫類殺菌劑福美雙和三唑類殺菌劑苯醚甲環唑對分生孢子萌發的抑制效果最明顯，EC50分別為0.004 mg/L和0.088 mg/L；其次為三唑類殺菌劑戊唑醇，EC50為1.824 mg/L；抑菌效果最差的為苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈，EC50高達34 283.529 mg/L。

3 討論與結論

通過形態學特征、rDNA-ITS序列分析并結合致病性測定，將引起山東省藍莓葉斑病和根腐病的病原菌鑒定為棒狀擬盤多毛孢。已有研究表明，擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）真菌在自然界中廣泛存在，種類繁多，多數種可引起植物病害，造成嚴重的經濟損失[9]。其中，棒狀擬盤多毛孢為多種作物葉斑病及根腐病病原菌[10，11]，也可以侵染藍莓引起病害，國外報道該病菌可以引起枝條潰瘍和枝枯病[12，13]，在國內可引起枝枯病[14，15]等。本研究證實棒狀擬盤多毛孢是引致藍莓葉斑病和根腐病的病原菌，并首次對該菌進行藥劑篩選。

雖然棒狀擬盤多毛孢菌可引起較為嚴重的病害，但針對該病原菌有效化學藥劑篩選的研究較少，尤其在藍莓病害上的藥劑篩選未見報道。本研究通過測定不同殺菌劑對棒狀擬盤多毛孢的抑制效果，篩選出了高毒力殺菌劑。三唑類殺菌劑苯醚甲環唑和有機硫類殺菌劑福美雙對棒狀擬盤多毛孢的菌絲生長抑制效果最好，同時對分生孢子萌發抑制效果也最好；苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈在生產上廣泛使用，但對藍莓棒狀擬盤多毛孢的菌絲生長和孢子萌發幾乎沒有抑制作用。其它不同類型殺菌劑的抑制效果、所篩選藥劑對藍莓葉斑病和根腐病的田間防效及其持效期還有待進一步測試。值得注意的是，化學藥劑過量使用會造成農藥殘留超標、影響食品安全、破壞生態環境等，因此，現代農業生產有害生物的防控需綜合應用各項防治措施并結合精準防控技術，從而降低化學農藥的使用量。

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