苯醚甲環唑農藥殘留檢測技術的研究進展

洪霞，錢瀅文，馮玉升，王懂帥，何海寧，汪永松，高志瑩，張彥軍，*

（1.甘肅省商業科技研究所有限公司，甘肅蘭州730010；2.甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司，甘肅蘭州730010）

苯醚甲環唑（difenoconazole）又名噁醚唑，化學名稱為順，反-3-氯-4-[4-甲基-2-（1H-1，2，4-三唑-1-基甲基）-1，3-二噁戊烷-2-基]苯基4-氯苯基醚，分子式 為 C19H17Cl2N3O3， 分 子 量 為 406.27，CAS號 為119446-68-3，其化學結構式如圖1所示。

圖1 苯醚甲環唑結構式Fig.1 The molecular structure of difenoconazole

苯醚甲環唑于1989年研發成功上市，銷售0.45億美元，2003年進入億美元產品之列，2013年銷售3.1億多美元。1999年我國第一次登記了10%苯醚甲環唑水分散粒劑產品，此后國內廠家競相開發，截至2015年，已登記含苯醚甲環唑的產品有540個，銷售3千多萬美元，是一種較好的殺菌劑品種[1]。苯醚甲環唑屬三唑類殺菌劑，是甾醇脫甲基化抑制劑，具有高效、廣譜、低毒、用量低的特點，其內吸性極強，通過抑制麥角甾醇（構成細胞膜的重要成分，對細胞膜的滲透性起重要作用）的生物合成，破壞細胞膜結構功能，從而達到殺菌目的，對蔬菜和瓜果的紋枯病、銹病、早疫病、葉斑病、黑星病、白粉病等具有很好的保護和治療作用，具有持效期長，與其他殺菌劑無交互抗性，不污染農產品，不殺傷天敵的優點[2-3]。

由于常規化學殺菌劑的長期使用及濫用，造成絕大多數病害對其產生抗性，致使其對靶標病害的防效大幅下降，只有大劑量使用時才有效，加大防治成本。基于苯醚甲環唑用量低、畝使用成本小、有持效期長等的優點，使得苯醚甲環唑大量使用，用來提高農作物的產量和品質。在查閱文獻的基礎上，對苯醚甲環唑的毒性、前處理方法和分析技術進行總結，為今后分析檢測各類樣品基質中苯醚甲環唑農藥殘留提供參考和依據。

1 苯醚甲環唑的毒性

由于苯醚甲環唑直接噴施在水果和蔬菜上，其留于蔬菜中通過食用進入人體，累積后可能會危害人體健康，對此，王筱芬等[4]對苯醚甲環唑毒性及致突變性進行了試驗研究，結果表明，雌性大鼠急性經口LD502 000 mg/kg，雄性大鼠為1 710 mg/kg，對兔皮膚和眼睛有刺激作用，對小鼠生殖細胞和體細胞無明顯旳遺傳損傷，對豚鼠無皮膚過敏，對蜜蜂無毒，屬于低毒類物質。劉綱華等[5]研究了10%苯醚甲環唑水分散粒劑施用于黃瓜地后，其有效成分苯醚甲環唑在黃瓜和黃瓜地土壤中的消解速率較快，消解半衰期均低于10 d；在最后一次施藥后7 d時，苯醚甲環唑在黃瓜中的最終殘留量均低于0.1 mg/kg，這說明苯醚甲環唑在黃瓜地中屬較易降解的農藥。綜上所述，苯醚甲環唑是一種安全，低毒，低污染環境和農副產品的殺菌劑。

2 苯醚甲環唑殘留的最大殘留限量

施用苯醚甲環唑為農作物的產量和品質提供了保證，但是不可避免地對環境造成污染，對人體和環境造成危害，殘留問題備受關注。因此，我國制定了不同基質中苯醚甲環唑的檢測方法（見表1），并且GB 2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》[6]對其殘留限量作了嚴格的規定，GB 2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》明確規定了苯醚甲環唑在谷物、油料、油脂、蔬菜、水果、堅果、糖料、飲料和藥用植物中的最大殘留限量。苯醚甲環唑農藥殘留的檢測標準見表1。

表1 苯醚甲環唑農藥殘留的檢測標準Table 1 National standards of difenoconazole pesticide residues

續表1 苯醚甲環唑農藥殘留的檢測標準Continue table 1 National standards of difenoconazole pesticide residues

由表1可知，苯醚甲環唑檢測適用范圍未全面覆蓋食品領域，且GB 2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》不能完全滿足苯醚甲環唑檢測標準的判定，對于蜂蜜、果汁、果酒、桑枝、金銀花、枸杞子、荷葉、食用菌、牛奶和奶粉的最大殘留限量沒有制定判定標準。因此，制定更全面的苯醚甲環唑檢測標準和不斷完善GB 2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》，對我國農產品中苯醚甲環唑農藥殘留的限量做出更嚴格的規定，形成基本覆蓋主要農產品的完善配套的農藥殘留標準體系十分有必要。

3 苯醚甲環唑殘留檢測技術

3.1 樣品前處理技術

現行用于苯醚甲環唑農藥殘留樣品前處理的方法有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、液相微萃取（liquid phase microextraction，LPME）、固相萃取（solid phase extraction，SPE）、固相微萃?。╯olid phase microextraction extraction，SPME）、分子印跡固相萃?。╩olecular imprinting solid phase extractio，MISPE）和分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，DSPE；又稱QuEChERS）等[16-18]，這些方法能夠很好地減少基質干擾，具有操作簡單、萃取效率高、省時省力、使用溶劑量少、對環境污染小等優點，在苯醚甲環唑農藥殘留分析樣品前處理中的應用最為廣泛。吸附材料是決定這些技術選擇性和靈敏性的關鍵因素，常見傳統的吸附材料有乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（graphitized carbon blacks，GCB）、 弗 羅 里 硅 土（Florisil）、氧化鋁（Al2O3）、活性炭、硅膠及氨基填料（NH2）等。由于納米材料的開發與應用成為前處理領域的研究熱點和發展趨勢，基于納米材料在吸附容量、吸附速度、吸附選擇性和使用成本等方面的優勢，目前其在苯醚甲環唑農藥殘留分析中的應用已引起越來越多的關注和重視。課題組[19]制備了多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）固相萃取柱，提取液以MWCNTs固相萃取柱凈化后用氣相色譜法質譜檢測，苯醚甲環唑檢出限為0.001 mg/kg。方法選擇性好，抗干擾能力強，適合蔬菜中苯醚甲環唑殘留量的定性確證分析和定量分析。Chen等[20]合成了離子液體功能化的Fe3O4碳納米管磁性分散固相萃取吸附材料，結合氣相色譜法質譜分析了水中苯醚甲環唑。結果顯示，該方法操作簡單快速，靈敏度高，環境友好，檢出限為0.16 ng/mL。

3.2 檢測技術

3.2.1 氣相色譜法

氣相色譜（gas chromatograph，GC）利用被分析物質的沸點、極性和吸附性質的差異來實現混合物的分離。該方法將樣品提取、凈化、濃縮后的苯醚甲環唑注入氣相色譜柱，苯醚甲環唑在固定相中分離，經檢測器掃描出色譜圖，通過保留時間來定性，通過峰面積與標準曲線來定量。該方法操作簡單、分析速度快、分離效能高、選擇性好等特點[21]。張春東等[22]建立了辣椒和土壤樣品中苯醚甲環唑殘留量的快速檢測方法，樣品于分液漏斗中用正己烷萃取，振蕩提取3次，濃縮后正己烷定容，GC檢測，線性范圍為0.01 mg/L～1.00 mg/L，檢出限為0.002 5 mg/kg。結果表明，正己烷提取辣椒和土壤中苯醚甲環唑效果較好，前處理過程不用過SPE小柱或層析柱等凈化操作，它具有高效率、低成本、高靈敏度、定量準確等優點。毛久浪等[23]建立了QuECh－ERS聯合GC測定毛豆樣品中苯醚甲環唑殘留量的方法，用該法檢測了68個批次樣品，其中20個毛豆仁樣品苯醚甲環唑殘留量均低于最大殘留限量0.02 mg/kg，48個帶莢毛豆樣品中有13個樣品中的苯醚甲環唑殘留量大于0.02 mg/kg，證明苯醚甲環唑主要殘留在毛豆莢中，去莢可降低毛豆仁苯醚甲環唑殘留的風險，降低食用毛豆時暴露于苯醚甲環唑的風險。表2列舉了應用GC進行苯醚甲環唑農藥殘留檢測的實例，由表2可知GC測定苯醚甲環唑農藥殘留主要使用電子捕獲檢測器（electroncapture detector，ECD）檢測器。

表2 苯醚甲環唑農藥殘留的GC檢測實例Table 2 Examples of GC for determination of difenoconazole pesticide residues

3.2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）主要適用于高沸點、熱穩定差、不易氣化或受熱易分解的農藥殘留的定量測定。由于氣相色譜方法需要較高的氣化溫度，而苯醚甲環唑存在異構體，在進樣后的氣化過程中立體結構易發生變化，高效液相色譜法可避免立體結構的變化而用于苯醚甲環唑農藥殘留分析檢測。紫外吸收檢測器（ultraviolet absorption detector，UV）不僅靈敏度高、噪聲低、線性范圍寬、有較好的選擇性，而且對環境溫度、流動相組成變化和流速波動不太敏感，既可用于等度洗脫，也可用于梯度洗脫，因此，HPLC-UV可應用于苯醚甲環唑農藥殘留的分析檢測。Li等[28]報道了一種簡單可靠的QuEChERS聯合HPLC方法檢測土壤和蔬菜中的苯醚甲環唑，苯醚甲環唑在 0.5 μg/mL～50 μg/mL 范圍內呈良好的線性關系，檢出限為0.1 μg/mL。該方法特異性強，精密度高，重現性好，不僅用于苯醚甲環唑及其代謝物的分析，而且成功檢測了土壤、番茄和黃瓜中苯醚甲環唑的6種對映異構體。表3列舉了應用HPLC進行苯醚甲環唑農藥殘留檢測的實例。

表3 苯醚甲環唑農藥殘留的HPLC檢測實例Table 3 Examples of HPLC for determination of difenoconazole pesticide residues

由表2和表3可知，與GC法相比，HPLC不需要考慮樣品的揮發性和熱穩定性，但是溶劑消耗大，檢出限高，分析時間長，UV檢測器沒有ECD檢測器靈敏度高，而且對樣品的凈化程度要求很高，但由于儀器價格便宜，普通檢測實驗室易于配備和使用，且操作維護簡單，在苯醚甲環唑農藥殘留的檢測中得到應用。

3.2.3 質譜法

質譜是稱量離子的“天平”，其基本原理采用多種離子化技術將待測物質離子化，再經過質量分析器和檢測器將這些離子按質荷比大小分離并排列成譜，然后通過標準品對照和質譜數據庫檢索，并結合特征離子的豐度值實現各組分的定性分析和定量分析。質譜以及色譜-質譜聯用技術的應用，使樣品的分離、定性和定量分析成為連續過程，與色譜的傳統檢測器相比，靈敏度更高，所需樣品的用量更少、分析速度更快、應用范圍更廣，目前以質譜作為檢測手段的農藥殘留分析方法已成為農藥殘留分析的主導技術和未來發展趨勢。在各種色譜-質譜聯用技術中，氣相色譜-質譜連用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-質譜連用技術（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、氣相色譜-串聯質譜（gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）以及液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）已在農藥殘留分析中得到廣泛應用。

應用GC-MS和LC-MS檢測苯醚甲環唑定性能力強，結果準確，分析速度快，但在復雜樣品中存在嚴重基質干擾物及共流出物時，容易產生假陽性結果。GC-MS/MS和LC-MS/MS利用獲得的離子豐富的結構信息，對苯醚甲環唑的結構加以確證，通過選擇離子模式，可以使樣品背景和噪音大大降低，在苯醚甲環唑農藥殘留的鑒定和定量分析中更具有優勢。李潔等[32]在茶葉中采用丙酮提取，經TPP-固相萃取小柱凈化后，用GC-MS/MS檢測。試驗結果表明，GC-MS/MS降低了苯醚甲環唑在實際檢測中的假陽性和誤判率，該方法的靈敏度較高、選擇性較好、抗干擾能力較強，可用于茶葉中苯醚甲環唑殘留的準確定量和定性分析。Chen等[16]比較了LPME聯合HPLC法和QuEChERS聯合LC-MS/MS法檢測豇豆中苯醚甲環唑的方法。結果表明，LPME具有操作簡單，環境友好的優點，QuECh－ERS具有凈化效果好，重現性高的優點，LC-MS/MS比HPLC線性范圍寬，靈敏度好，兩種方法都得到滿意的結果。質譜法分析苯醚甲環唑速度快，檢出限低，可獲得準確的定性和定量結果。但是，質譜儀價格昂貴，運行成本高，需要嚴格的操作技能，限制了它的應用，沒有單純用GC、HPLC普及。表4列舉了應用MS進行苯醚甲環唑農藥殘留檢測的實例。

3.2.4 其他方法

表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman spec－troscopy，SERS）指被檢測物在一些特殊制備的金屬導體（如金、銀等）表面或溶膠中，拉曼散射信號比普通拉曼散射信號強度增加104倍～106倍的現象。SERS具有檢測速度快、所需樣本量小和操作簡單等優點，在農藥殘留檢測方面具有很大的應用潛力[43-44]。熊俊飛等[45]采用表面增強拉曼光譜技術結合快速溶劑前處理方法快速分析芹菜中苯醚甲環唑農藥殘留。利用乙腈提取芹菜汁，采用PSA、C18和GCB去除芹菜汁中的脂肪酸、蠟質、色素和固醇等熒光物質，樣本的基底采用OTR202和OTR103金納米顆粒作為表面增強試劑。結果表明，1192cm-1特征峰強度與以芹菜汁為基質的苯醚甲環唑溶液濃度在1 mg/L～10 mg/L范圍內具有良好的線性關系，相關系數為0.962 2，最低檢測濃度1 mg/L，回收率為 92.4%～113.2%，RSD在8.83%～12.4%之間。該方法操作簡單，單個樣本檢測時間在20 min內完成，基本滿足國家規定的殘留限量要求。

表4 苯醚甲環唑農藥殘留的MS檢測實例Table 4 Examples of MS for determination of difenoconazole pesticide residues

續表4 苯醚甲環唑農藥殘留的MS檢測實例Continue table 4 Examples of MS for determination of difenoconazole pesticide residues

酶聯免疫吸附技術（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是酶免疫測定技術中應用最廣泛的技術，是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，通過酶與底物產生顏色反應，用洗滌法將液相中的游離成分除去后再進行定量測定。目前ELISA技術已被應用于諸多的食品檢測領域，具有儀器成本低、方便、快捷、靈敏度高、檢測結果準確等眾多優勢。同時存在難以分析多種成分，對某些結構類似物的分析檢測仍會出現交叉反應影響檢測結果，過度依賴試劑的選擇等缺點[46-47]。劉冰等[48]研究了通過苯醚甲環唑半抗原的設計及合成，人工抗原的制備，多克隆抗體的制備及純化，最終建立了苯醚甲環唑的直接競爭ELISA方法，其靈敏度 IC50為（67.96±2.73）μg/L，檢測限 IC15為（8.86±0.34）μg/L，選取10種果蔬類樣品，經正己烷提取，磷酸鹽緩沖液稀釋后，回收率為89.01%～103.43%，變異系數小于14.33%，檢出限為0.443 mg/kg。本研究所建立的直接競爭ELISA方法，靈敏度和特異性較高，樣品處理簡單，為農產品中苯醚甲環唑殘留的有效監管提供了一種高效的檢測工具。

4 結論與展望

首先，目前苯醚甲環唑殘留檢測方法主要采用質譜法，但是質譜法對于復雜基質會出現假陽性結果。從當前的發展趨勢看，采用串聯質譜法建立苯醚甲環唑殘留檢測方法，開展苯醚甲環唑殘留精準篩查已成為研究的重點，以及其在食品中的代謝規律研究將成為新的研究熱點。其次，伴隨生物傳感技術和酶聯免疫吸附技術的發展，今后開發具有操作簡捷、成本低廉、高效靈敏的苯醚甲環唑殘留快速檢測方法，滿足食品中苯醚甲環唑殘留的現場快速檢測是關鍵。再次，不斷完善苯醚甲環唑農藥殘留檢測標準，使其更全面覆蓋我國食品領域。制定既符合我國又能與國際接軌的更細致的苯醚甲環唑農藥殘留限量標準，確保食品安全。最后，對于苯醚甲環唑農藥殘留是“產”出來的，而不是“檢”出來的。因而，加強苯醚甲環唑農藥使用的源頭管理，樹立科學的施藥觀念，提倡少用、不用和安全用藥，從源頭上消除苯醚甲環唑農藥殘留，提高農產品的安全水平，促進我國農產品的持續健康發展。