巖藻多糖的抗癌活性研究進展

閆洪雪，孫占一，趙麗麗，張鵬鵬，劉翔

（1.青島明月海藻集團有限公司海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室，山東青島266400；2.青島明月海藻集團有限公司，山東青島266400）

海藻是廣泛存在于各海域中的海洋植物，且種類豐富，主要包括褐藻、紅藻、綠藻、藍藻、微藻等，其富含的活性物質(zhì)也涵蓋了多糖、萜類、蛋白、多酚、甾醇、環(huán)狀多硫化合物、大環(huán)內(nèi)酯、微量元素等幾大門類[1-2]。巖藻多糖是廣泛存在于褐藻表面的黏滑成分，是一種多糖硫酸酯，主要有兩種類型骨架，分別是以重復(fù)的C-1，3鍵結(jié)合的 α-L-巖藻糖和以 C-1，3 鍵、C-1，4鍵交替結(jié)合的α-L-巖藻糖（如圖1所示[3]）。

圖1 褐藻中的兩種巖藻多糖結(jié)構(gòu)[3]Fig.1 Two kinds of diatomaceous polysaccharide structure in brown algae[3]

其硫酸基團多位于4號位，少數(shù)位于3號位，是一種天然的雜聚糖[4-6]，研究表明，巖藻多糖可以直接發(fā)揮抗癌作用，也可以通過增強免疫力間接殺死癌細胞（如激活自然殺傷細胞和巨噬細胞）。直接發(fā)揮作用涉及細胞周期特別是G1期的阻滯，誘導(dǎo)細胞凋亡、抗血管生成和抑制細胞轉(zhuǎn)移等，這些過程是相互關(guān)聯(lián)的[7-8]。此外，巖藻多糖還具有抗凝血[9]、抗氧化[10]、抗幽門螺旋桿菌[11]等生物學活性。與化學合成藥物相比，天然提取物因其生物活性廣泛和副作用低被用來作為抗腫瘤藥物引起了患者越來越多的關(guān)注。許多研究表明，巖藻多糖對腫瘤細胞有細胞毒性作用，且對一般的細胞無毒副作用[12-15]。本文綜述了巖藻多糖在抗腫瘤方面的研究進展及相關(guān)的作用機制，為巖藻多糖抗腫瘤應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 巖藻多糖的抗癌活性

研究發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖抗癌活性主要包括3個方面。

第一，巖藻多糖能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，通過調(diào)節(jié)癌細胞生長周期，影響癌細胞正常的有絲分裂，抑制癌細胞增殖。Yang等將從墨角藻中提取的巖藻多糖注射到患有淋巴瘤的小鼠體內(nèi)，觀察小鼠體內(nèi)腫瘤體積的變化，發(fā)現(xiàn)巖藻多糖能夠有效地抑制體內(nèi)腫瘤細胞的生長[16]。此外，巖藻多糖通過激活癌細胞的凋亡信號，引起癌細胞DNA損傷，染色體凝聚，誘導(dǎo)癌細胞自發(fā)凋亡。Yamasaki-Miyamoto等將來自于裙帶菜孢子葉中提取的巖藻多糖與人乳腺上皮細胞（human mamma－ry epithelial cells，HMEC）和人乳腺癌細胞 MCF-7（human breast cancer cell）共同培養(yǎng)，從細胞凋亡檢測結(jié)果來看，巖藻多糖誘導(dǎo)核間體DNA片段化，染色質(zhì)濃縮，caspase-7、-8、-9 的激活以及聚腺苷二磷酸核糖（ribose，adenosine-diphosphate ribose，ADP） 聚合酶的裂解，這些數(shù)據(jù)表明巖藻多糖能夠通過caspase-8依賴性途徑在MCF-7細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡[17]。

第二，巖藻多糖能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的生成，抑制腫瘤血管的新生，切斷瘤體的營養(yǎng)供給源，餓死腫瘤，最大程度地阻斷癌細胞的擴散和轉(zhuǎn)移。Koyanagi等研究發(fā)現(xiàn)天然的和過硫酸化的巖藻多糖都可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子165與其細胞表面受體結(jié)合來抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮生長因子165（VEGF165）的有絲分裂和趨化作用。過硫酸化的巖藻多糖還抑制了在小鼠體內(nèi)肉瘤180細胞誘導(dǎo)的新生血管形成。在小鼠Lewis肺癌和B16黑色素瘤中也觀察到了其抑制作用。這些結(jié)果表明，巖藻多糖的抗腫瘤作用與其抗血管生成的作用有關(guān)，且增加在巖藻多糖分子中的硫酸基團的數(shù)量有助于提高其抗血管生成和抗腫瘤的活性[18]。

第三，巖藻多糖還能夠活化人體的免疫系統(tǒng)，增強自然殺傷性細胞（natural killer cell，NK細胞）和T細胞殺傷腫瘤細胞的能力。Zhang等將來自于巖衣藻、巨藻、裙帶菜、墨角藻中提取的巖藻多糖分別注射到小鼠體內(nèi)，觀察小鼠體內(nèi)自然殺傷細胞的活性及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的濃度，研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖能夠有效地提升NK細胞的殺傷活性，并能促進體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤壞死因子[19]。

1.1 巖藻多糖抗結(jié)腸癌活性

Vishchuk等將從褐藻Saccharina cichorioides中提取的巖藻多糖作用于人結(jié)腸癌細胞DLD-1細胞系，發(fā)現(xiàn)其可以通過抑制上皮生長因子作用，來抑制腫瘤細胞增殖[20]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖作用于人結(jié)腸癌細胞HCT116中，通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，引起細胞凋亡，并可激活caspase（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）-9，caspase-3，引發(fā) DNA 損傷[21]。Thinh等將從莫氏馬尾藻中提取的巖藻多糖SmF1、SmF2、SmF3作用于結(jié)腸癌細胞DLD-1體現(xiàn)了極小的細胞毒性并能有效抑制癌細胞的增殖[22]。Kim等研究了巖藻多糖對人結(jié)腸癌細胞HT-29和HCT116的細胞凋亡的影響，其研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖誘導(dǎo)HT-29和HCT116人類結(jié)腸癌細胞凋亡是通過死亡受體和線粒體介導(dǎo)的凋亡通路介導(dǎo)的[23]。Azuma等給患結(jié)腸癌的小鼠口服低分子量（6.5 kDa～40 kDa）、中等分子量（110 kDa～138 kDa）和高分子量（300 kDa～330 kDa）的巖藻多糖，發(fā)現(xiàn)食用中等分子量的巖藻多糖可明顯抑制結(jié)腸癌腫瘤細胞的生長，口服低分子量和高分子量巖藻多糖的小鼠的存活時間相對于對照組有顯著提高，同時還發(fā)現(xiàn)口服巖藻多糖后小鼠脾臟中NK細胞的數(shù)量也有顯著增加[24]。

1.2 巖藻多糖抗乳腺癌活性

Yamasakimiyamoto等研究了巖藻多糖對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的誘導(dǎo)過程。凋亡實驗結(jié)果表明，巖藻多糖誘導(dǎo)了核間質(zhì)DNA的碎裂、染色質(zhì)凝聚、caspase-7、-8、-9的激活和聚ADP核糖聚合酶的裂解。其研究表明巖藻多糖可以通過MCF-7細胞中的caspase-8依賴通路誘導(dǎo)凋亡細胞死亡[25]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)用巖藻多糖處理可以下調(diào)轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231乳腺癌細胞中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）的表達以及在轉(zhuǎn)移性HCT116結(jié)腸癌細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasimic reticulum，ER）蛋白29（endoplasimic reticulum protein，ERp29）的表達。巖藻多糖可以促進ER Ca2+依賴的鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II（calmodulin depedent kinase II，CaMKII）磷酸化，以及 B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）相關(guān)的 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）以及級聯(lián)蛋白12在MDA-MB-231細胞中的表達[21]。Vishchuk等研究了從褐藻中提取的巖藻多糖對小鼠表皮細胞JB6Cl41、人類結(jié)腸癌DLD-1、乳腺癌T-47D、黑色素瘤RPMI-7951細胞系的作用，發(fā)現(xiàn)巖藻多糖能夠有效抑制人類癌細胞增殖且對小鼠表皮細胞毒性極低[26]。此外，科學家通過 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]法測定以劑量依賴性的方式證實用巖藻糖處理可以降低人乳腺細胞MCF-7的活細胞數(shù)量；通過流式細胞術(shù)檢測用巖藻多糖處理的MCF-7細胞的G1期阻滯，發(fā)現(xiàn)其與細胞周期蛋白D1和CDK-4基因表達的減少有關(guān)。膜聯(lián)蛋白V（Annexin-V）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色結(jié)果表明，凋亡細胞數(shù)量與細胞色素C、caspase-8、Bax、Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平相關(guān)。研究結(jié)果表明，巖藻多糖可通過調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達誘導(dǎo)G1期MCF-7細胞阻滯和細胞凋亡[27]。巖藻多糖還能抑制乳腺癌細胞4T1和人乳腺癌復(fù)蘇形式細胞MDA-MB-231的生長，并減少其細胞集落的形成[28]。

1.3 巖藻多糖抗肝癌活性

越來越多的證據(jù)顯示了巖藻多糖的抗腫瘤活性。巖藻多糖可通過抑制細胞周期，誘導(dǎo)多種癌癥細胞包括肝細胞癌（hepatic celluler cancer，HCC）的凋亡來體現(xiàn)抗腫瘤的活性。通過研究其對microRNA表達的影響，科學家發(fā)現(xiàn)其可顯著上調(diào)人類HCC細胞的微小核糖核酸-29b（microRNA-29b，miR-29b），同時抑制其下游目標DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3B（DNA methyltransferase，DNMT3B）的表達。而被DNMT3B抑制的轉(zhuǎn)移抑制因子 1（tumor metastasis suppressor gene 1，MTSS1）的信使核糖核酸（Messenger RNA，mRNA）和蛋白水平則在使用巖藻多糖處理后顯著升高。此外，巖藻多糖還下調(diào)肝癌細胞的轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）受體和SMAD信號[細胞內(nèi)傳遞骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號的分子叫做SMAD，由果蠅中 MAD（mother against decapentaplegic）和線蟲中同源分子SMA（small body size）兩個名稱合并而成]。這些效應(yīng)能夠抑制和防止細胞外基質(zhì)降解，并減少HCC細胞的侵襲活性[29]。而將人類肝癌細胞smm-7721細胞用巖藻多糖處理后則顯示明顯的生長抑制和凋亡，出現(xiàn)幾個典型特征如染色質(zhì)冷凝和邊緣化，數(shù)量減少，線粒體腫脹和空泡等。研究還發(fā)現(xiàn)巖藻多糖誘導(dǎo)的肝癌細胞smm-7721凋亡與減少谷胱甘肽（glutathione，GSH）的消耗有關(guān)，同時還提高了細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平并伴有線粒體超微結(jié)構(gòu)損壞，線粒體膜電位的去極化等。這些證據(jù)表明巖藻多糖可通過ROS介導(dǎo)的線粒體通路來誘導(dǎo)肝癌細胞smm-7721凋亡[30]。癌細胞轉(zhuǎn)移是癌癥導(dǎo)致死亡的主要原因之一。這是一個涉及多個基因的復(fù)雜的生物學過程、步驟和階段。它還與癌癥細胞的許多生物活動密切相關(guān)，如生長、入侵、粘連、血源轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移等。Cho等研究了巖藻多糖的抗肝癌細胞轉(zhuǎn)移效應(yīng)和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵信號的作用。體外研究和體內(nèi)試驗均證明巖藻多糖可通過對分化相關(guān)基因1（N-myc downstream regulated gene 1又稱calciumassociated protein 43，NDRG-1/CAP43）-依賴性因子 ID-1的抑制作用來抑制肝癌細胞的侵襲性[31]。研究人員用從裙帶菜孢子葉中提取的巖藻多糖處理具有高侵襲性和淋巴轉(zhuǎn)移潛能小鼠肝癌細胞系Hca-F，在體內(nèi)和體外都能檢測到巖藻多糖對癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。體內(nèi)試驗結(jié)果表明隨著巖藻多糖的濃度和處理時間的增長表現(xiàn)出抑制作用，體外試驗則發(fā)現(xiàn)其能夠抑制Hca-F細胞的生長、遷移、侵襲和粘附能力[32]。此外，巖藻多糖還可以通過上調(diào)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases2/1，p42/44 mapk） 介導(dǎo)的NDRG-1/CAP43來抑制肝癌細胞的侵襲，并可以在常氧量條件下通過上調(diào)p42/44 mapk介導(dǎo)的空泡膜蛋白（vacuolar membrane protein 1，1VMP-1）的表達顯著降低體內(nèi)肝癌細胞轉(zhuǎn)移，并通過caspase-8的衰減、caspase-7解離和抑制caspase-8和Fas相關(guān)死亡域的活化，降低膽汁酸誘導(dǎo)的肝細胞凋亡[33]。

1.4 巖藻多糖抗肺癌活性

科學家用從裙帶菜中提取的巖藻多糖處理人肺癌細胞A549細胞，發(fā)現(xiàn)其有強烈的抗增殖活性。研究還發(fā)現(xiàn)巖藻多糖通過下調(diào)p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2絲裂原激活的蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase1/2 mitogen-activated protein kinase，ERK1/2 MAPK）通路來誘導(dǎo)A549細胞的凋亡[34]。Moreau等用從海藻中提取的巖藻多糖處理人類非小細胞支氣管肺癌NSCLC-N6細胞，其體現(xiàn)的抗增殖效應(yīng)及化學藥物抵抗力有望在體外實現(xiàn)。處理后細胞的生長在細胞周期的G1期似乎受到抑制，且預(yù)處理的細胞動力學研究表明，這種生長阻滯是不可逆轉(zhuǎn)的[35]。Huang等研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖可以減輕C57BL/6小鼠的病毒性癥狀并能抑制C57BL/6小鼠中Lewis肺癌細胞的肺轉(zhuǎn)移[36]。另有學者研究了從鄂霍次克海褐藻中提取的巖藻多糖在移植了Lewis肺癌細胞的C57BL/6小鼠中的抗腫瘤、抗癌細胞轉(zhuǎn)移的活性。研究發(fā)現(xiàn)在單次重復(fù)用藥后，以10 mg/kg的劑量服用巖藻多糖，可產(chǎn)生中度抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移效果[37]。研究還發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖抑制了在小鼠體內(nèi)肉瘤180細胞誘導(dǎo)的新生血管形成。在小鼠Lewis肺癌和B16黑色素瘤的生長中也觀察到了抑制作用。這些結(jié)果表明，巖藻多糖可以通過其抗血管生成的能力，增加抗腫瘤活性的有效性[38]。

1.5 巖藻多糖抗白血病活性

Jin等研究了巖藻多糖對人類髓性白血病細胞凋亡和巖藻多糖介導(dǎo)的信號通路。研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖通過激活促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶1和2（mitogen-activated protein kinase kinase kinase1/2，MEK1/2）、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）和c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）能夠誘導(dǎo) HL-60、NB4、THP-1 細胞凋亡，但不能誘導(dǎo)K562細胞的凋亡。用巖藻多糖處理HL-60細胞，能夠誘導(dǎo)caspase-8、-9、-3的激活、Bid的分裂和線粒體膜透性的改變[39]?？茖W家通過用巖藻多糖喂養(yǎng)小鼠，研究巖藻多糖對小鼠A20白血病細胞腫瘤生長的影響及T細胞受體轉(zhuǎn)基因（DO-11-10-Tg）小鼠中T細胞介導(dǎo)免疫的反應(yīng)。在食物中添加巖藻多糖喂養(yǎng)的小鼠，抑制淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)染的卵清蛋白的溶解活性增強，NK細胞的殺傷作用也顯著增強[40]。Yang等通過體內(nèi)和體外試驗確定了巖藻多糖在彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）細胞中抗腫瘤活性。用巖藻多糖處理可引起G0/G1期細胞周期阻滯，并伴有細胞周期蛋白激酶抑制因子p21的上調(diào)和細胞周期蛋白D1、周期蛋白依賴性激酶 4（cyclin-dependent kinases4，CDK4）、CDK6 的下調(diào)。此外在DLBCL細胞株和主DLBCL細胞中也誘導(dǎo)了細胞凋亡、線粒體膜電位的喪失、細胞色素C和細胞凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體進入細胞質(zhì)[41]。

1.6 巖藻多糖抗膀胱癌活性

用巖藻多糖處理人類膀胱癌細胞5637發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖表現(xiàn)出明顯的生長抑制功能，這表現(xiàn)在促進G1期相關(guān)上調(diào)因子細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（cyclin-dependent kinase inhibitor 1，p21WAF1）的表達和抑制細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶的表達。同時還發(fā)現(xiàn)使用巖藻多糖處理還能夠抑制膀胱癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵染，這是通過阻斷核轉(zhuǎn)錄因子-B（nuclear transcription factorB，NF-B）和激活子蛋白-1（activatorprotein1，AP-1）的激活來抑制基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloprotein9，MMP9）的表達而實現(xiàn)的。在另一種膀胱癌T24細胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[42]。Han等報道了巖藻多糖誘導(dǎo)的人膀胱癌細胞5637凋亡與Bax/Bcl-2比率的增加、線粒體膜的消散和線粒體中細胞色素C的釋放有關(guān)。在同樣的試驗條件下，用巖藻多糖處理能夠降低人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）表達及原癌基因轉(zhuǎn)錄因子（proto-oncogene transcription factor，c-myc）和刺激蛋白 1（stimulating protein 1，Sp1）的表達。這伴隨著端粒酶活性的降低。同時發(fā)現(xiàn)用巖藻多糖處理還能抑制PI3K/Akt信號通路的激活，這能夠增強巖藻多糖誘導(dǎo)的凋亡和降低端粒酶活性[43]。此外研究還發(fā)現(xiàn)低分子量的巖藻多糖可以抑制缺氧刺激的H2O2的形成、低氧誘導(dǎo)因子-1積累、轉(zhuǎn)錄活性血管內(nèi)皮生長因子的分泌，以及低氧性人膀胱癌細胞T24的遷移和侵襲。還能抑制T24膀胱癌細胞中低氧活化信號PI3K/AKt/mTOR（mammalian target of rapamycin，哺乳動物雷帕霉素靶向基因）/p70S6K（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70核糖體蛋白 S6激酶）/4EBP-1（Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，真核轉(zhuǎn)錄起始因子4E結(jié)合蛋白1）的磷酸化[44]。

1.7 其他抗癌活性

Vishchuk等用200 μg/mL巖藻多糖添加量處理人黑素癌細胞RPMI-7951細胞系，發(fā)現(xiàn)使用巖藻多糖處理能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長周期，影響腫瘤細胞有絲分裂[45]。而用5 mg/kg巖藻多糖添加量喂養(yǎng)小鼠，研究對小鼠黑素瘤細胞B16的作用，則發(fā)現(xiàn)巖藻多糖能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達，抑制腫瘤血管生成，同時還發(fā)現(xiàn)巖藻多糖過硫酸化后效果更好[46]。Boo等用從裙帶菜中提取的巖藻多糖以200 μg/mL的用量來處理人前列腺癌細胞PC-3細胞系，發(fā)現(xiàn)巖藻多糖處理后可以激活ERK1/2 MAPK，抑制p38 MAPK和PI3K/AKt信號通路，促進前列腺癌細胞PC-3的細胞凋亡[47]。此外用巖藻多糖治療移植了人前列腺癌細胞DU-145的小鼠，發(fā)現(xiàn)添加巖藻多糖喂養(yǎng)的小鼠，p38 MAPK和PI3K/Akt信號通路被抑制，促進細胞凋亡，且Bcl-2基因表達也受到抑制，同時還能夠激活caspases-9，引發(fā)DNA損傷[48]。

2 展望

癌癥是多種病因的多因素疾病。具有細胞分化和增殖異常、生長失去控制、浸潤性和轉(zhuǎn)移性等生物學特征，其發(fā)生是一個多因子、多步驟的復(fù)雜過程，與吸煙、感染、職業(yè)暴露、環(huán)境污染、不合理膳食、遺傳因素等密切相關(guān)。癌癥主要通過腫瘤細胞擴散到遠端器官（轉(zhuǎn)移）而導(dǎo)致死亡[49]。目前治療癌癥主要依賴傳統(tǒng)治療方式，手術(shù)、放療、化療等，副作用嚴重。因此，使用低毒性的天然物質(zhì)是科學家和醫(yī)學家們最感興趣的。目前，科學家們在體外和體內(nèi)的研究已經(jīng)證明了巖藻多糖的抗腫瘤的作用，包括在各種癌癥細胞中抑制生長[49-52]、轉(zhuǎn)移[53-54]、血管生成[38，53]和誘導(dǎo)細胞凋亡[49，55-56]。此外，巖藻多糖還能夠與巨噬細胞作用產(chǎn)生細胞因子和趨化因子增強機體的免疫功能，從而間接抑制腫瘤細胞的生長[57]。巖藻多糖還具有免疫調(diào)節(jié)作用，因此在與化療藥物及放療進行聯(lián)合使用時，可緩解化療帶來的副作用[11]。綜上所述，巖藻多糖在治療癌癥方面具有很大的潛力，未來將會有更多的研究來探索其在治療癌癥方面的機理和功能，更好地為新藥研究提供方向。