遮陰處理對茶樹葉色表型及生化成分的影響

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(1.賀州學院,廣西賀州 542899; 2.福建農林大學安溪茶學院,福建泉州 362400; 3.福建農林大學園藝學院,福建福州 350002; 4.閩臺特色作物病蟲害生態防控協同創新中心,福建福州 350002; 5.福建省茶產業工程技術研究中心,福建福州 350002)

光照對花青素合成相關結構基因的影響已有大量研究[3-6]。研究表明,光照是影響月季花變色的重要環境因子,遮光阻礙了花青素的合成,降低了CHS基因的表達,導致花冠不能正常著色[7]。山川紫甘薯葉片的CHI基因受到光信號的誘導,光的強度越大,基因的表達量越高[8]。在強光誘導下,擬南芥中的F3H基因表達量上調;弱光下,該基因表達量下調[9]。目前,光照對紫葉茶樹葉色表型的機理尚不清晰。

本試驗通過對紫葉茶樹進行遮陰處理,誘導葉色變異;測定不同處理下各樣本中的葉綠素相對含量、茶多酚、兒茶素組分、黃酮總量及組分、總花青素苷的含量,分析其對葉色表型及生化成分的影響。這一問題的解答對解析光照調控紫葉茶樹葉色表型及理化成分的含量有著理論價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料為武夷奇種C18 由福建省武夷山市茶葉研究所資源圃提供;花青素(純度>97%)、山奈酚(純度 97.7%)、楊梅素(純度95%)、槲皮素(純度 95%)標準品 美國ChromaDex公司;表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC,純度>99%)、表兒茶素(epicatechin,EC,純度>99%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG,純度>99%)、兒茶素(catechin,C,純度>99%)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG,純度>99%)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG,純度>99%)、咖啡堿(純度>99%)標準品 美國Sigma公司;福林酚、磷酸、甲醇、碳酸鈉、茚三酮、三氯化鋁、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀(分析純)、甲醇、乙腈(色譜純) 國藥化學試劑有限公司。

FA1004型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;722S型可見分光光度機 北京瑞利分析儀器有限公司;e2695型高效液相色譜儀、2998型PDA檢測器 美國Waters公司;植物粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;TDL-40B離心機 北京亞力恩科學器材公司;DHG-9123A 型電熱鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;NF333型色差儀 Nippon Denshoku Industries Co. Ltd.,Japan。

1.2 實驗方法

1.2.1 遮陰處理 試驗在福建省武夷山市茶葉研究所資源圃中完成。2015年4月中旬,挑選生長發育良好、整齊一致、樹形基本相似的植株27株,分為3組(每9株為1組,每重復3株),掛牌標記,并對其進行同一高度的修剪。待茶樹芽頭萌動之時,開始遮陰處理。根據前期研究結果設2個處理:分別用遮陰75%和60%的黑色遮陽網遮光,以全光照處理為對照。經過15 d的遮陰處理,取經遮陰處理和全光照處理(CK)的武夷奇種C18葉片(第一葉位),參考GB/T 8303-2013 《茶 磨碎試樣的制備及其干物質含量測定》,采用120 ℃烘干固樣,得到葉片粉末,分裝于不同的自封袋,并做好標記。

1.2.2 葉色表型分析 用NF333型色差儀測定葉片CIEL*a*b*值,使用色差儀以光源C/2 °為條件測量葉片的顏色,取葉片正面,平置于干凈的白紙上,將集光口對準葉片中部位置進行測量,最終取5個測量的平均值,數據經Excel 2007分析。

1.2.3 葉綠素相對含量的測定 對“武夷奇種C18”進行不同程度的遮陰處理,15 d后,用SPAD-502葉綠素儀測定鮮葉(第一葉位)葉綠素相對含量,分別在葉片的上、中、下部位測定,每個部位重復6次,結果取3個部位的平均值。

腦卒中是嚴重威脅人類生命健康的常見病之一，也是發病率、致殘率、致死率極高的危險疾病，給病人及家庭造成嚴重的經濟及精神負擔[11]。家庭照顧者是腦卒中病人家庭康復照護主力，其優質的照護服務對腦卒中病人病情恢復和生活質量提高具有重要作用。但長時間的護理照顧會使照顧者產生巨大的精神壓力，誘發照顧者各種負性情緒。陳軍軍[2]研究發現：腦卒中家庭照顧者中35.9%有抑郁癥狀，53.2%有焦慮癥狀，較高的照顧者負性情緒不僅不利于照顧者身心健康，還可引發照顧者流失率增高、照顧質量下降，甚至發生病人虐待現象。

1.2.4 花青素苷總量的測定

1.2.4.1 花青素標準曲線的繪制 準確配制質量濃度為0.50 mg/mL的花青素標準溶液,分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于6支10 mL具塞比色管中,各加入甲醇溶液至1.0 mL,然后加入6.0 mL正丁醇-鹽酸溶液(體積比為95∶5)和0.2 mL質量分數為2%的硫酸鐵銨溶液,搖勻后,置沸水浴中加熱40 min,然后迅速冷卻,在波長400～680 nm處進行掃描,確定其最大吸收波長657 nm,于最大吸收波長處測定花青素標準溶液吸光度,得到標準曲線方程。

1.2.4.2 葉片粉末花青素含量的測定 先用無水乙醇和濃鹽酸配制0.1 mol·L-1的鹽酸乙醇溶液,然后分別取不同處理葉片粉末各1.000 g,放入回流裝置中,再加入20 mL的鹽酸乙醇溶液,在60 ℃的水浴鍋中浸提回流60 min。回流結束后,將提取液倒入25 mL的容量瓶中,定容到25 mL。以0.1 mol·L-1的鹽酸乙醇溶液作為參比液,在分光光度計下測定提取液在530、657 nm的吸光值[10]。

1.2.4.3 花青素含量的計算 花青素含量(mg/g)=(OD530-0.25×OD657)/M

式中:OD530:花青素在530 nm波長下的光密度;OD657:花青素在657 nm波長下的光密度;M:取樣質量。

1.2.5 葉片粉末茶多酚總量、兒茶素組分的測定 參照國標GB/T 8313-2008茶葉粉末中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法。

1.2.6 葉片粉末黃酮總量及黃酮苷元的測定 黃酮總量測定采用三氯化鋁比色法:稱取1.2得到的茶葉粉末1.00 g于100 mL三角瓶中,加沸蒸餾水40 mL,置水浴鍋中浸提30 min,過濾到50 mL容量瓶,加水定容,搖勻為供試液。吸取供試液0.5 mL,加1%三氯化鋁溶液至10 mL,搖勻10 min后移入1 mL比色皿,用水代替茶湯作為空白試驗,在波長420 nm處測其吸光度。

1.2.6.1 黃酮苷元的測定方法 參考李家華等[11]建立的液相色譜法。色譜柱:TSK gel ODS-80TM色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動相:A相:0.2%磷酸水溶液;B相:100%甲醇。梯度從30%B到80% B,流速0.8 mL/min,55 min內完成,檢出波長360 nm,柱溫40 ℃,進樣量10 μL,每一次完成后系統平衡10 min后再次進樣。每個樣品6次重復。

1.2.6.2 黃酮苷元標準液的制備 分別精密稱取楊梅素、槲皮素和山柰酚對照品適量,加甲醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液,作為對照品溶液。精密吸取3種對照品溶液1 mL置10 mL的容量瓶中,加甲醇至刻度,作為混合標準儲備液溶液。分別取楊梅素、槲皮素和山柰酚對照品溶液用甲醇稀釋得到0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 mg/mL的系列標準使用液。用封口膜密封后置冰箱中冷藏備用。

1.2.6.3 黃酮苷元供試品溶液的制備 用水浴加熱回流裝置制備供試品溶液。將1.2.1得到的茶葉粉末,精確稱取粉末1.00 g,加甲醇40 mL,鹽酸4 mL,置于圓底燒瓶中回流水解1.5 h(85 ℃),過濾,濾液置50 mL容量瓶,用少許甲醇洗滌殘渣及容器,洗滌液并入容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)過濾,即得。

1.3 數據處理

本試驗中各數據均為個獨立重復試驗的平均值±標準差。試驗數據采用SPSS 20.0數據統計軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同遮陰處理下紫葉茶樹葉片的表型特征

“武夷奇種C18”在不同遮陰處理下,葉片的表型特征發生了變化(如表1)。用色差儀NF333 測定發現,+a*到-a*的轉變意味著紅紫色減退,綠色增強,-b*到+b*的變化代表了藍色逐漸消退,黃色增強。與CK相比，75%遮陰葉片的紅紫度減退,藍度降低,即呈更弱的著色(如圖1)。結果表明，光照越強,葉片的呈色越紫。這是由于，強光促使花青素合成途徑的結構基因的表達上調,從而使花青素的含量增加。

表1 不同遮陰處理下葉片的表型特征Table 1 Phenotypic characteristics of leaves under different shading treatments

圖1 不同遮陰處理下茶樹葉片(第一葉位)Fig.1 Tea leaves(first leaf position) under different shading treatments注:A:CK;B:60%遮陰;C:75%遮陰。

2.2 不同遮陰處理對紫葉茶樹葉片葉綠素相對含量的影響

“武夷奇種C18”在不同遮陰處理下,葉片的葉綠素相對含量發生了變化(如圖2)。圖2的檢測結果表明,正常光照下,葉綠素相對含量較低,75%遮光下的葉綠素相對含量最高,不同遮陰處理下葉綠素相對含量差異達到顯著水平(p<0.05)。

圖2 不同遮陰處理對葉片葉綠素相對含量的影響Fig.2 Effect of different shading treatments on the relative content of chlorophyll in leaves注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)；圖3、圖4、圖6同。

2.3 不同遮陰處理對紫葉茶樹葉片花青素苷總量的影響

為研究光照強弱對紫葉茶樹葉片呈色的影響,設置不同遮陰處理,檢測其花青素苷總含量(圖3)。結果表明,光照越強,花青素苷總含量越高;光照越弱,花青素苷總含量越低。且不同遮陰處理下花青素苷總量差異達到極顯著水平(p<0.01)。這一結果與觀測到的葉片表型特征一致。這是由于，強光促使花青素合成途徑的結構基因的表達上調,從而使花青素的含量增加。弱光則抑制花青素合成途徑,結構基因表達下調,花青素含量降低。

圖3 不同遮陰處理對紫葉茶樹葉片花青素苷總含量的影響Fig.3 Impact on the total content of anthocyanin purple leaf tea leaves of different shading treatments注：不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。

2.4 不同遮陰處理對茶樹葉片茶多酚總量的影響

花青素苷是植物新陳代謝過程中產生的類黃酮物質,是類黃酮途徑的一個分支途徑。兒茶素屬于黃烷醇類化合物,是茶葉中多酚類物質的主體成分。這些物質除了同屬于類黃酮途徑,還是茶葉當中的主要功能性成分，同時也能解析光照強弱對茶葉主要功能性成分含量的影響。

“武夷奇種C18”在不同遮陰處理下,葉片的茶多酚含量發生了變化(圖4)。從圖4可看出,未經過遮陰處理的CK組的茶多酚含量最高。與對照組相比,60%遮陰程度的處理組茶多酚含量減少了17.81%,75%遮陰處理組則減少了25.54%。且不同遮陰處理下茶多酚含量差異達到顯著水平(p<0.05)。結果表明,光照較強,茶多酚含量較高;隨著遮陰程度的加深,茶多酚含量減少。這與閻意輝等[12]研究遮陰處理對云抗10號茶樹新梢的影響結果是一致的。

圖4 不同遮陰處理對紫葉茶樹葉片茶多酚含量的影響Fig.4 Effect of tea polyphenols purple leaf blades of different shading treatments

2.5 不同遮陰處理對茶樹葉片兒茶素組分的影響

“武夷奇種C18”在不同遮陰處理下,葉片的茶多酚含量發生了變化(如圖5和表2)。由圖5和表2可知,在兒茶素組分中,未遮陰的CK與60%遮陰的酯型兒茶素的總量都要高于非酯型兒茶素,而75%遮陰處理則是非酯型兒茶素總量要略高于酯型兒茶素。從整體來看,EGCG含量較高,其次是EGC、EC與ECG的含量。從TC(總兒茶素)含量可看出,遮陰程度最高的75%遮陰的TC含量最低,為7.6%;未遮陰的CK組含量則最高,為10.91%;數值為遮陰程度居中的60%遮陰含量也位于兩者之間,為8.65%。結果表明,光照較強,總兒茶素含量較高;隨著遮陰程度的加深,總兒茶素含量減少。這是由于，弱光抑制兒茶素合成途徑結構基因的表達,從而使總兒茶素含量減少。

表2 不同遮陰處理對紫葉茶樹兒茶素組分含量的影響(%)Table 2 Effect of different shading treatments on content of purple leaf tea catechin component(%)

圖5 不同遮陰處理下紫葉茶樹兒茶素組分圖Fig.5 Purple leaf tea catechin components of different shading treatments

2.6 不同遮陰處理對茶樹葉片黃酮總量及組分的影響

“武夷奇種C18”在不同遮陰處理下,葉片的黃酮總量發生了變化。從圖6可以看出,隨著遮陰程度的加深,武夷奇種C18幼嫩新梢中的黃酮總量也呈下降趨勢。且不同遮陰處理下黃酮總量差異達到顯著水平(p<0.05)。與CK對照組相比,60%遮陰處理的減少了14.36%,75%遮陰處理的則減少了29.08%。結果表明:黃酮總量會隨著遮陰程度加深而減少。這是由于弱光抑制黃酮合成途徑結構基因的表達,從而使黃酮總量減少。

圖6 不同處理對紫葉茶樹黃酮苷總量的影響Fig.6 Different treatments on the total amount of purple leaf tea flavonoid glycosides

測定水解后不同處理下紫葉茶樹中含量較高的3種黃酮苷元楊梅素、槲皮素、山奈酚(圖7和表3),從圖7和表3可以發現未遮陰的CK組的楊梅素、山奈酚、槲皮素等組分含量居于三組之最,遮陰程度最深的75%遮陰組的各組分含量則是三組最低的。結果表明,黃酮組分含量會隨著遮陰程度加深而減少。這是由于，弱光抑制黃酮合成途徑中FHT結構基因的表達,從而使楊梅素、山奈酚、槲皮素組分含量減少。

圖7 不同遮陰處理下紫葉茶樹黃酮組分圖Fig.7 Purple leaf tea flavonoid component diagram under different shading treatments

表3 不同遮陰處理對紫葉茶樹黃酮組分的影響(mg/g)Table 3 Effect of different shading treatments on purple leaf tea flavonoid component(mg/g)

3 討論與結論

花青素是決定茶樹葉片顏色的主要色素,屬于茶樹次生代謝產生的類黃酮化合物[13]。目前已知茶葉中主要含有3種花青素[14-17],花青素在細胞中合成,但在液泡中積累,產生的顏色從紅到紫[18-20]。其中,矢車菊色素是紫紅色;飛燕草色素和錦葵色素是紫色。在茶樹葉片細胞中合成的花青素在液泡轉運蛋白GST等轉運因子作用下運輸到液泡中[14]。最后在內因和外因共同作用下,茶樹葉片呈現紫色或紅紫色。迄今為止,花青素苷合成的關鍵結構基因已從茶樹中分離獲得[21-28]。光照對茶樹花青素合成途徑相關基因的影響已有報道。對新梢白化茶樹品種“黃金芽”進行遮陰處理,結果抑制了CHS3基因的表達[29]。但是對于光照這個重要環境因子影響紫葉茶樹葉色表型的機理尚不清晰。

本研究將紫葉茶樹進行不同程度的遮陰處理,結果表明,伴隨著遮陰程度的加深,紫葉茶樹葉片中葉綠素相對含量呈逐漸上升的趨勢,75%遮陰條件下葉綠素相對含量最高;而花青素苷含量呈現出下降的趨勢,正常光照條件下(CK)總花青素苷含量最高。這與金魚草、矮牽牛和非洲菊[30-32]等植物中的研究結果相似。這說明光照強弱和著色有著密切的關系,光照增強,葉片呈深紫色,即葉片能夠正常著色;光照減弱,葉片呈淡紫色、綠色或呈白色,即葉片不能夠正常著色,這可能受到共同的上游途徑調控。隨著遮陰程度的加深,紫葉茶樹葉片中茶多酚、兒茶素組分、黃酮總量及組分都呈現出下降的趨勢,正常光照條件下(CK)這些含量最高。這與閻意輝[12]等人的研究結果相似。

本研究解析了紫葉茶樹葉片在不同遮陰處理下主要生化成分的變化:光照越強,茶多酚、兒茶素組分、黃酮總量、黃酮組分、總花青素苷的含量越高,反之,則越低。但要闡明光照調控紫葉茶樹葉片中花青素苷合成與呈色的機理,還需要進行大量的工作。比如進一步研究紫葉茶樹葉片中花青素苷合成途徑對光信號響應的分子途徑;通過比較不同光照條件下基因表達模式和花青素苷含量的差異,找出關鍵的結構基因;進一步克隆相關基因的啟動子片段,為深入解析光照誘導紫葉茶樹葉色變異的分子機理提供參考。