有機溶劑萃取高效液相色譜法檢測玉米漿中黃曲霉毒素B1

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(湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室,工業發酵湖北省協同創新中心,湖北武漢 430068)

黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是一類以黃曲霉和寄生曲霉為代表的霉菌產生的次級代謝產物,人類通過玉米、堅果或牛奶等食品可能攝入不定量的黃曲霉毒素,而導致營養不良、免疫抑制和肝細胞癌變等癥狀。在18種黃曲霉毒素中,黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的毒性最強,且廣泛存在于各類糧食和經濟作物中,所以AFB1被世界衛生組織(World Health Organization,WHO)列為毒物之首,2002年被國際腫瘤研究機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)列為Ⅰ級強致癌物[1-3]。

玉米漿是利用濕法工藝生產玉米淀粉的副產物,其含有可溶性蛋白、游離脂肪酸、可溶性糖類和維生素等多中營養物質。玉米漿是微生物和動物的重要營養原料,被廣泛用作優質氮源添加到微生物的培養基中[4],或作為蛋白質來源直接添加到動物飼料中[5]。玉米漿中的毒素來源主要是原材料玉米,另外由于玉米漿的生產工藝耗時長,其過程中可能產生霉變,也能導致霉菌毒素的產生,最后影響所得到產品的安全性[6-7]。根據我國GB 2761-2011《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》規定，玉米及其制品中AFB1限量標準為20 μg/kg,而且在飼料中的限量標準低于10 μg/kg[8]。目前,在我國的飲食、飼料等加工產品中,AFB1的存在是個亟待解決的問題[9-10],所以針對于原料中的AFB1的檢測,需要一個簡單有效的方法。

目前有很多檢測AFB1的方法,主要有薄層層析法(TLC)[11]、液相-質譜聯用法(LC-MS)[12-13]、酶聯免疫吸附層析法(ELISA)[14-15]、高效液相色譜法(HPLC)[16],其中HPLC具有檢測效率高、操作簡便、定量準確的特點,受權威機構認可。在我國的國家標準AFB1檢測方法主要有HPLC法。但是國標法中柱前衍生容易導致檢測的重復性差,導致結果缺乏可信度,而且操作復雜,容易受樣品中其他物質的干擾。

因此本文通過簡單預提取凈化方法,利用不同的有機溶劑萃取AFB1,并分析了溫度、流動相等各種影響因素[17-18],選擇合適的高效液相色譜條件利用簡單的紫外檢測即可檢測AFB1,建立了簡單、廉價的檢測玉米漿中黃曲霉毒素B1的方法,為食品安全提供進一步的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米漿(包括玉米漿濕樣和干樣) 收集山東濰坊盛泰藥業有限公司;黃曲霉毒素標品 以色列Fermentek公司;甲醇、乙腈 Sigma;二氯甲烷 國藥集團科技有限公司;氯仿 國藥集團科技有限公司。

LC-20AD高效液相色譜儀(配SPD-20A紫外檢測器) 日本Shimadzu公司;真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;BILON-6000Y噴霧干燥機 上海比朗儀器制造有限公司;恒溫電磁攪拌水浴鍋 河南予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米漿中毒素的提取與凈化 稱取玉米漿干樣和濕樣各20 g分別置于100 mL三角瓶,再加入20 mL有機溶劑(甲醇、乙腈、二氯甲烷、氯仿)萃取,利用磁力攪拌器100 r/min攪拌20 min,25 ℃,9000 r/min離心5 min,吸取離心管最下層有機溶液,重復上述萃取步驟2次,并將收集的有機層溶液溶液集中于一管。將萃取收集的溶液至于真空干燥箱,45 ℃真空干燥2 h,干燥后加入1 mL甲醇得到AFB1甲醇溶液,-20 ℃保存待檢測。

1.2.2 色譜條件 高效液相色譜儀:LC-20AD;紫外檢測器:SPD-20A;色譜柱:C18Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm);初始流速:0.7 mL/min;進樣量:20 μL。檢測波長:365 nm;初始流動相∶甲醇/水=50∶50。初始柱溫:25 ℃。

1.2.3 萃取劑的篩選 取空白玉米漿干粉樣按1 μg/mL的AFB1標準加標,分別用甲醇、乙腈、二氯甲烷和氯仿4種有機溶劑按1.2.1方法萃取,按1.2.2 HPLC條件檢測,計算標樣萃取后的回收率。

1.2.4 色譜條件的優化 流動相優化:柱溫25 ℃,流速0.7 mL/min,先用了甲醇/水(50∶50)、乙腈/水(50∶50)體系,在甲醇/水(50∶50)的基礎上,甲醇占比不變的條件下,加入5%乙腈代替5%水,以5%為梯度逐步增加乙腈的占比至甲醇/乙腈(50∶50)，觀察AFB1峰型及出峰時間。柱溫優化:在流動相甲醇/乙腈/水(50∶30∶20)、流速0.7 mL/min條件下,在25、30、35 ℃柱溫條件下，觀察AFB1峰型及出峰時間。流速:在優化的流動相甲醇/乙腈/水(50∶30∶20),柱溫30 ℃條件下,在流速為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min觀察AFB1峰型及出峰時間。所檢測的AFB1來源于混有1 μg/mL AFB1標樣的空白玉米漿中的AFB1峰型和出峰時間。

1.2.5 標準曲線的繪制 配制0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg/mL的AFB1標準溶液,HPLC檢測,以AFB1濃度為橫坐標,峰面積為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.6 對照試驗 用本研究的方法和GB/T 5009. 22-2016檢測5個不同批次干樣和濕樣中的AFB1,每個批次5個平行,取平均值作為對應批次檢測的AFB1含量[19]。

1.3 數據處理

實驗中每組實驗重復三次以上,采用SPSS 19.0軟件進行數據的顯著性分析,應用Croeldraw X4.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 萃取劑選擇

4種有機溶劑萃取后的AFB1回收率如表1所示,可以發現4種有機溶劑萃取標樣的回收率都很高,同時根據4種萃取后所呈現的色譜圖(圖1)分析,由甲醇和乙腈所萃取的樣品的雜質含量較高,可能因為有其他一些偏水溶性物質同樣溶于甲醇和乙腈,而不溶于二氯甲烷和氯仿這些極性相對較弱的有機試劑。為了減少檢測中雜質的干擾,同時考慮到有機溶劑的安全性(氯仿相對于二氯甲烷更不穩定,毒性更大),二氯甲烷的沸點較氯仿要低,更易揮發,選用二氯甲烷做萃取劑。

圖1 不同有機溶劑萃取玉米漿中標樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard sample extracted from corn syrup by different organic solvents注:A:甲醇;B:乙腈;C:二氯甲烷;D:氯仿。

圖2 不同流動相組成呈現的AFB1色譜圖Fig.2 Chromatogram of AFB1 presented by different mobile phases注:A:甲醇/水=50∶50;B:乙腈/水=50∶50;C:甲醇∶乙腈∶水=50∶30∶20。

2.2 色譜條件優化

2.2.1 流動相 目前,AFB1檢測用的常用流動相組合會因為儀器、樣品等其他條件而異,常用的有機溶劑主要包括甲醇、乙腈、異丙醇、三氯甲烷。根據GB/T 5009.22-2016規定流動相為水、乙腈和甲醇，并采用等梯度洗脫,但是在檢測過程中，基線容易發生偏移，導致定量的準確性下降。

本文首先考慮等梯度洗脫,分別應用了甲醇/水(50∶50)、乙腈/水(50∶50)體系,乙腈/水體系出峰慢,響應相對較差,而甲醇/水體系的洗脫效果欠佳,所以當甲醇/乙腈/水形成三元混合流動相有了更好的分離效果,且響應效果好。以空白玉米漿為樣品按1 μg/mL標準加入AFB1標樣,其他條件不變的情況下進行了流動相配比優化,并最終確定了以甲醇/乙腈/水(50∶30∶20)為流動相。經過此流動相的洗脫,AFB1峰基本可以和雜峰分離開(圖2)。

2.2.2 柱溫 在一定情況下,柱溫會影響到分離效率,也可能改變檢測物質的成分。因此,在其他的色譜條件不變的前提下，比較了25、30、35 ℃柱溫下的色譜圖,結果發現在30 ℃時呈現峰型較好,分離度高,且沒有多的雜峰,而當溫度過低，出峰時間過晚,溫度過高，雜峰數明顯增多,影響檢測定量的準確性(圖3)。

2.2.3 流速 在其他條件不變的前提下，比較了流速0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min時樣品所呈現的色譜圖的峰,結果如圖4,在流速為0.7 mL/min時,出峰時間相對適宜,且分離效果比較理想。

2.3 標準曲線及線性范圍

如前所述,分別配制0. 4、0. 8、1.2、1.6、2.0 μg/mL AFB1標準系列溶液,在所優化的色譜條件下測定,用峰面積與標準溶液的質量濃度繪制標準曲線,AFB1的質量濃度在0.4～2.0 μg/mL的范圍內呈線性關系,線性回歸方程為y=83564x+1648,相關系數r為0. 9988,其線性范圍0.4～2.0 μg/mL。

2.4 樣品檢測的回收率和精密度

用上述方法分別提取濕玉米漿和玉米漿干粉按表所示量添加AFB1,然后進行萃取凈化、HPLC檢測,每個樣品3個平行,重復5次。根據標準曲線計算出回收率和相對標準偏差(RSD),根據表中數據可證明本方法檢測玉米漿中的黃曲霉毒素B1具有可行性。

圖3 不同柱溫下呈現的AFB1色譜圖Fig.3 Chromatogram of AFB1 presented by different column temperatures注:A:25 ℃;B:30 ℃;C:35 ℃。

圖4 不同流速下呈現的AFB1色譜圖Fig.4 Chromatogram of AFB1 presented by different flow rates注:A:0.5 mL/min;B:0.6 mL/min;C:0.7 mL/min;D：0.8 mL/min;E：0.9 mL/min;F：1.0 mL/min。

表2 檢測樣品的回收率和精確度Table 2 Recovery and precision of the tested samples

2.5 對照實驗

選取污染的玉米漿5個批次濕樣和干樣,根據GB/T 5009. 22-2016所規定的樣品提取凈化方法和本實驗的提取凈化方法,然后進行HPLC檢測,所得結果如表3所示。對兩種方法進行線性回歸分析的回歸方程:y=0.9878x+0.123,R2=0.9949,經過t檢驗(p>0.05)和F檢驗(F=0.002

目前,還沒有對玉米漿中AFB1的檢測及去毒方法的明確報道。在AFB1的提取和凈化方面,本方法沒有通過制作凈化柱來提取并凈化樣品中的AFB1,而用有機溶劑萃取凈化，更為便捷。在檢測方面,本方法和國標法相比,省去了復雜的衍生步驟,而且設備成本更加低廉,得到的結果具有準確性、可靠性。

3 結論

表3 本方法與國標方法檢測玉米漿的結果對比Table 3 Comparison of the results of testing corn syrup by this method and the national standard method

圖5 AFB1的標準曲線Fig.5 Standard curve of AFB1

注:p=0.9609>0.05,F=0.0025

本文優化了一種檢測玉米漿中黃曲霉毒素B1的方法,結果發現該方法與國標法檢測結果無顯著差異(p>0.05),該方法更簡單、廉價,安全性好,適用于玉米漿中AFB1的檢測,有助于對玉米制品、飼料等制品的質量安全的有效控制。該方法同樣還可以適用于一些非油類食品或者食品原料(玉米粉、豆粕粉等)中的AFB1檢測,但不適用于一些油類物質中的毒素檢測,油類物質可能會影響到AFB1的萃取效率,也可能會有一些易溶于有機溶劑的其他天然化合物對AFB1的檢測產生干擾,針對不同類型的樣品,需要找到對應的適宜的處理方法[20],才能更快、更精確地保障一些產品的質量問題。