大孔樹脂純化紅樹莓籽黃酮及其體外結合膽酸鹽能力評價

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(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.大連中超食品有限公司,遼寧大連 116400; 3.遼寧新大地實業發展集團有限公司,遼寧沈陽 110168)

紅樹莓是薔薇科懸鉤子屬植物,鮮果酸爽多汁,營養豐富,具有多種保健功效,被世界糧農組織譽為第三代“黃金水果”[1-2]。紅樹莓加工產生的副產物紅樹莓籽常被丟棄,未得到充分利用。紅樹莓鮮果約含10%紅樹莓籽,若將其所含黃酮類化合物加以利用,不僅能夠變廢為寶，而且可以提高紅樹莓附加值[3-4]。黃酮類化合物具有抗氧化、調節血脂及抑菌消炎等生理活性[5-6]。

黃酮類化合物純化方法主要有溶劑萃取法、膜分離法及樹脂法等[7],大孔樹脂具有選擇性好、吸附量大、吸附速度快及純化效果好等優點,廣泛用于黃酮類化合物純化[8]。聶超等[9]采用大孔樹脂純化倫晚臍橙總黃酮,純化后純度達33.45%。唐巧玉等[10]利用大孔樹脂純化金橘果皮總黃酮,純化后的總黃酮純度達38.2%。目前,采用大孔樹脂對紅樹莓籽黃酮類化合物純化研究較少。

高血脂癥即血液中膽固醇和脂肪的代謝或運轉異常疾病,主要表現為甘油三酯、血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量高,而高密度脂蛋白膽固醇含量低[11]。高血脂能夠引發動脈粥樣硬化、心肌梗死及其它心血管病[12]。化學類藥物能夠有效治療高血脂癥,但都有一定毒副作用,因此天然降血脂活性物質的開發必將成為研究熱點。膽固醇降解會產生膽汁酸鹽,黃酮類化合物能夠與膽酸鹽結合,降低膽汁酸的重吸收率,促進肝臟或血液中的膽固醇降解,生成更多膽酸鹽,從而降低血液中膽固醇含量[13]。胡凱等[14]通過構建體外模型,比較不同茶浸提液對膽酸鹽的結合能力影響,結果表明茶葉中的功能性成分有降血脂功效。體外消化模型不僅重現性好,且簡單易操作,因此本文通過構建體外消化模型來考察黃酮的降血脂功效。

本研究通過大孔樹脂對紅樹莓籽黃酮進行動態吸附及解析試驗,確定紅樹莓黃酮純化最佳條件,為大孔樹脂純化紅樹莓籽黃酮應用提供理論依據;其次,以紅樹莓籽黃酮對膽酸鹽結合率為指標,進行紅樹莓籽體外降血脂能力評價,為開發天然降血脂藥物提供理論依據,同時也為紅樹莓籽開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓籽 大連中超食品有限公司;AB-8大孔樹脂 天津市光復精細化工研究所;鹽酸、亞硝酸鈉、檸檬酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇 分析純,天津市天力化學試劑有限公司;牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉 上海金穗生物科技有限公司。

ALPHA1-2 LD plus冷凍干燥機 北京奧創興業有限公司;UV2700紫外分光光度計 日本島津公司;RE-52旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;XZ-1真空泵 上海西利嘉真空設備制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅樹莓籽黃酮提取 按照實驗室前期優化條件進行提取,取一定量60目紅樹莓籽粉,以料液比1∶10 g/mL加入石油醚,在40 ℃下浸泡4 h,抽濾后取粉,40 ℃干燥2 h,按1∶30 g/mL加入80%乙醇,在50 ℃下水浴提取2 h,所得提取液在55 ℃下旋轉蒸發至膏狀,并于冷凝溫度-54 ℃，真空度20 Pa下真空冷凍干燥24 h,制得紅樹莓籽粗黃酮粉,備用。

1.2.2 紅樹莓籽黃酮濃度的測定 參照谷楠楠[15]的方法顯色,蘆丁標曲Y=7.75X+0.047,R2=0.9996,計算黃酮濃度。

1.2.3 AB-8大孔樹脂純化紅樹莓籽黃酮

1.2.3.1 大孔樹脂預處理 取一定量AB-8大孔樹脂在95%乙醇中浸泡24 h,充分溶脹后用去離子水沖洗至無味,再經4%鹽酸浸泡12 h,蒸餾水洗至中性,再經5 mg/mL氫氧化鈉浸泡12 h,蒸餾水洗至中性,45 ℃干燥備用[16]。

1.2.3.2 上樣量對紅樹莓籽黃酮吸附效果影響 取1.2.3.1中AB-8樹脂20 g濕法上柱,稱取一定量1.2.1中粗黃酮粉用去離子水溶解制成10 mg/mL樣液;調節pH至4.5、總上樣量150 mL、以1.5 mL/min上樣,流出液每10 mL收集一管,前10 mL棄去,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,當管內黃酮含量為初始黃酮濃度1/10時視作泄漏[17]。

1.2.3.3 上樣pH對紅樹莓籽黃酮吸附效果的影響 取1.2.3.1中AB-8樹脂20 g濕法上柱,稱取一定量1.2.1中粗黃酮粉去離子水溶解制成10 mg/mL樣液,上樣量150 mL,調節樣液pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5,以1.5 mL/min上樣,收集流出液,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,計算吸附率,吸附率計算公式如下[18]:

式中:C0-上樣液黃酮濃度,mg/mL;V0-上樣液體積,mL;C1-流出液黃酮濃度,mg/mL;V1-流出液體積,mL。

1.2.3.4 上樣流速對紅樹莓籽黃酮吸附效果的影響 取1.2.3.1中AB-8樹脂20 g濕法上柱,稱取1.2.1中粗黃酮粉,用去離子水溶解制成10 mg/mL樣液,取100 mL樣液,調節pH至4.5,上樣流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min,收集流出液,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,計算其吸附率。

1.2.3.5 洗脫劑用量對紅樹莓籽黃酮解吸效果的影響 稱取1.2.1中粗黃酮粉,用去離子水溶解制成10 mg/mL樣液,取100 mL樣液,調節pH至4.5,以1.5 mL/min流速上樣,吸附完全后,用去離子水洗至流出液無色,量取200 mL的80%乙醇以1.5 mL/min流速洗脫,流出液每10 mL收集一管,前10 mL棄去,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,繪制洗脫曲線。

1.2.3.6 洗脫劑濃度對紅樹莓籽黃酮解吸效果的影響 稱取1.2.1中粗黃酮粉,用去離子水溶解制成10 mg/mL樣液,取100 mL樣液,調節pH至4.5,以1.5 mL/min流速上樣,吸附完全后,用去離子水洗至流出液無色,量取150 mL的濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇,以1.5 mL/min的流速洗脫,收集流出液,前10 mL棄去,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,計算解吸率,解吸率計算公式如下[19]:

式中:C0-上樣液黃酮濃度,mg/mL;C1-吸附后流出液黃酮濃度,mg/mL;C2-解吸后流出液黃酮濃度,mg/mL;V1-上樣液體積,mL;V2-洗脫液體積,mL。

1.2.3.7 洗脫流速對紅樹莓籽黃酮解吸效果的影響 以最佳吸附條件上樣吸附完全后,用去離子水洗至流出液無色,量取150 mL濃度為70%的乙醇,分別0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速洗脫,收集流出液,前10 mL棄去,按1.2.2中方法測定黃酮濃度,計算解吸率。

1.2.3.8 AB-8大孔樹脂純化驗證試驗 依據試驗得到最佳條件純化紅樹莓籽黃酮,將純化后的黃酮液旋轉蒸發至膏狀,并置于真空冷凍干燥機中干燥24 h,取一定量用60%乙醇溶解,測定黃酮濃度,計算純度,純度計算公式如下[20]:

式中:C-黃酮濃度,mg/mL;V-樣液體積,mL;m-黃酮干粉質量,mg。

1.2.4 紅樹莓籽黃酮體外結合膽酸鹽能力的測定

1.2.4.1 膽酸鹽標準曲線 稱取一定量膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉,用磷酸緩沖溶液(pH6.3)溶解并配制成0.3 mmol/L標準溶液;分別取上述溶液0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于試管中,加磷酸緩沖溶液補齊至2.5 mL,再加入7.5 mL 60%硫酸,搖勻后于70 ℃水浴20 min,取出后冰浴5 min,在387 nm測吸光度。以膽酸鹽濃度為橫坐標,樣液吸光度為縱坐標,繪制標準曲線[21]。

1.2.4.2 膽酸鹽含量及結合率測定方法 取3組樣品分別加入4 mL牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、膽酸鹽溶液,37 ℃水浴恒溫振蕩1 h后,在8000 r/min條件下離心10 min。取2.5 mL上清液按1.2.4.1法顯色,以緩沖液代替樣品作為空白,測定吸光度值計算膽酸鹽含量樣品[22]。結合率計算公式如下:

式中:C0-為空白組中膽酸鹽含量,mmol/mL;C1-樣品中膽酸鹽含量,mmol/mL。

1.2.4.3 不同提取及純化方式黃酮制備 a. 醇提紅樹莓籽黃酮:參照本實驗室前期優化條件,取一定量60目紅樹莓籽粉,按1∶30 g/mL加入80%乙醇,50 ℃提取2 h,所得提取液旋轉蒸發至膏狀,置于真空冷凍干燥機中干燥24 h,制得紅樹莓籽粗黃酮粉備用。

b. 纖維素酶輔助提取黃酮:參照本實驗室前期優化條件,取一定量60目紅樹莓籽粉按1∶40 g/mL加入60%乙醇,纖維素酶加入量0.01 mg/mL,pH5.5,提取溫度55 ℃下提取40 min,其余操作同醇提黃酮。

c. 超聲波輔助提取紅樹莓籽黃酮:參照本實驗室前期優化條件,取一定量60目紅樹莓籽粉按1∶30 g/mL加入60%乙醇,在50 ℃超聲功率175 W條件下提取50 min,其余操作同醇提黃酮。

d. AB-8大孔樹脂純化紅樹莓籽黃酮:按上述1.2.3中最佳條件吸附并解吸,收集解吸液并將其旋轉蒸發,其余操作同醇提黃酮。

1.2.4.4 不同提取方式黃酮對膽酸鹽結合能力影響 稱取1.2.4.3中4種樹莓籽黃酮各0.25 g,參照李俶[23]等的方法進行體外胃消化2.5 h,以胃消化2.5 h作為腸消化的0 h,按閔芳芳等[24]的方法進行體外腸消化2.5 h,取經體外胃腸道消化后的樣液,在8000 r/min條件下離心10 min,取上清液2.5 mL,按1.2.2.2方法測定膽酸鹽含量,計算結合率。

1.3 數據處理

上述試驗每組均重復3次,單因素取平均值作圖,采用office辦公軟件作圖,IBM SPAS Statistics 22.0軟件進行方差分析;利用Design-Expert 8.0.1軟件進行響應面數據分析。顯著水平0.05。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂純化紅樹莓籽黃酮工藝

2.1.1 上樣量對紅樹莓籽黃酮吸附效果的影響 上樣量是影響樹脂吸附效果的重要因素,上樣量少,樹脂不能吸附飽和,產率低;上樣量大,樹脂吸附飽和后無法繼續吸附,樣液直接流出[25]。如圖1所示,隨著收集的流份增加,紅樹莓籽黃酮濃度逐漸增大,當收集到第10管時,黃酮濃度達到初始濃度的1/10,樹脂達到了泄漏點,當超過10管后黃酮濃度迅速增大,可能是樹脂吸附量已達到飽和。因此,為避免黃酮樣液浪費,選取100 mL為紅樹莓籽黃酮最佳上樣量。

圖1 泄漏曲線Fig.1 The curve of adsorption leakage

2.1.2 上樣pH對紅樹莓籽黃酮吸附率的影響 pH能夠影響黃酮的電離程度,改變其存在形式和溶解度,進而影響黃酮類化合物與大孔樹脂間作用力,從而影響大孔樹脂對黃酮類化合物的吸附效果[26]。如圖2可知,隨著pH升高，紅樹莓籽黃酮吸附率逐漸增加,當pH達到4.5時，吸附率達到最大,而后吸附率開始緩慢降低。因此選擇4.5為最佳上樣pH。

圖2 上樣pH對紅樹莓籽黃酮吸附率影響Fig.2 Effect of sample pH on the adsorption of flavonoids注:圖中不同字母表示梯度間存在顯著性差異(p<0.05),圖3、圖5～圖7同。

2.1.3 上樣流速對紅樹莓籽黃酮吸附率的影響 上樣流速對樹脂吸附效果有明顯影響,上樣流速過快,樣液與樹脂接觸時間短,吸附效果不好,上樣流速過慢則吸附時間延長,效率降低,試驗周期長[27]。由圖3可知,隨著上樣流速的增加其吸附率逐漸降低,當流速超過1.5 mL/min時,吸附率顯著降低(p<0.05),考慮到試驗周期及生產效率,因此選擇1.5 mL/min為最佳上樣流速。

圖3 上樣流速對紅樹莓籽黃酮吸附率影響Fig.3 Effect of flow rate on the adsorption of flavonoids

2.1.4 洗脫劑用量對紅樹莓籽黃酮洗脫效果的影響 由圖4可知,隨著洗脫劑用量增加,洗脫出的黃酮濃度顯著升高,當洗脫體積為60 mL時,黃酮濃度達到最大值。超過60 mL后再繼續增加洗脫劑用量,黃酮濃度逐漸降低,當洗脫劑用量增至150 mL時,黃酮濃度幾乎為0,因而選取150 mL為最佳洗脫劑用量。

圖4 AB-8大孔樹脂洗脫曲線Fig.4 Desorption curve of AB-8 resin

2.1.5 乙醇濃度對紅樹莓籽黃酮解吸率影響 不同體積分數乙醇對紅樹莓籽黃酮解吸率影響如圖5所示。隨著乙醇體積分數增加,解吸率明顯上升,當體積分數為60%時,解吸率達到最高，為80.7%,乙醇濃度超過60%時,解吸率迅速降低,這可能是由于乙醇體積分數過大,解吸出的雜質也隨之增加,使得解吸率降低[18]。因此確定60%乙醇為最佳洗脫濃度。

圖5 乙醇濃度對紅樹莓籽黃酮解吸率影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the desorption rate

2.1.6 洗脫流速對紅樹莓籽黃酮解吸率影響 由圖6可知,當流速在0.5～1.5 mL/min范圍內,解吸率緩慢降低,洗脫流速為1.5 mL/min時,解吸率為89.3%,而后隨著洗脫流速的增加,解吸率迅速降低。洗脫流速過慢,試驗循環周期相應延長,流速過快，會導致洗脫劑與大孔樹脂不充分,紅樹莓籽黃酮不能完全被洗脫下來。為提高純化效率,選擇1.5 mL/min為最佳洗脫流速。

圖6 洗脫流速對紅樹莓籽黃酮解吸率影響Fig.6 Effect of ethanol flow rate on the desorption rate

2.1.7 紅樹莓籽黃酮純化工藝驗證 根據試驗結果,采用最佳吸附解吸條件重復3次進行驗證試驗,得到樹脂的平均吸附率為84.04%,解吸率為91.23%,將所得洗脫液濃縮、凍干后,得到純化的黃酮粉末,純度由原來的25.07%提高至48.19%,產品純度提高了23.12%,說明該工藝條件穩定可行,可有效提升紅樹莓籽黃酮純度。

2.2 紅樹莓籽黃酮體外結合膽酸鹽效果評價

2.2.1 膽酸鹽標準曲線 牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉的回歸方程依次為:y=14.473x+0.0407,R2=0.9995;y=11.41x+0.0075,R2=0.9995;y=23.168x+0.036,R2=0.9993。3個標準曲線線性關系良好,可計算膽酸鹽濃度。

2.2.2 不同提取方式黃酮粉結合膽酸鹽效果評價 不同方式提取的紅樹莓籽黃酮凍干粉與牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉3種膽酸鹽的結合能力如圖7所示。3種提取法及純化黃酮對3種膽酸鹽結合能力最強的均是AB-8純化黃酮，AB-8純化黃酮對牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉結合率依次為79.35%、74.88%和74.56%。其中，AB-8純化黃酮和醇提黃酮對膽酸鈉結合率分別為74.56%和73.06%，差異不顯著(p>0.05)，結合效果較好。從整體分析,AB-8純化黃酮對3種膽酸鹽結合能力較強,其余依次為醇提、超聲波和酶提黃酮。

圖7 紅樹莓籽黃酮粉對膽酸鹽吸附率的影響Fig.7 The effect of flavonoids on the adsorption rate of cholate salt

3 結論

通過AB-8大孔樹脂動態吸附及解吸試驗,確定純化紅樹莓籽黃酮最佳條件:在pH4.5、流速1.5 mL/min條件下上樣100 mL;以60%乙醇為洗脫劑,在流速1.5 mL/min下洗脫150 mL,紅樹莓籽黃酮純度由25.07%升高到48.19%,提高了23.12%,說明AB-8大孔樹脂適用于紅樹莓籽黃酮的純化,可為后續黃酮單體分離提供參考。

AB-8純化黃酮對牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉結合率依次為79.35%、74.88%和74.56%,說明結合能力較強,其余依次為醇提、超聲波和酶提黃酮,由此表明，紅樹莓籽黃酮對膽酸鹽結合能力良好,且結合效果最好的是經AB-8純化的黃酮,可為開發天然降血脂藥物提供理論依據。